海洋細菌𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. Dが生産する殺藻性化合物Questiomycinsとその生産合図について

Topic outline

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  General
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  発表論文

  • 掲載誌：molecules

    （moleculesは、Creative Commons, CC BY 4.0を受けています。）
    

    タイトル：Questiomycins, Algicidal Compounds Produced by the Marine Bacterium 𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. D and Their Production Cue

    著者：

    Saki Umetsu

    Mamoru Kanda

    Ichiro Imai

    Ryuichi Sakai

    Masaki J.Fujita

    URL： https://www.mdpi.com/1420-3049/24/24/4522/htm

    論文公開日：2019年12月10日

    
    

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  概要

  • 有害藻類𝘊𝘩𝘢𝘵𝘵𝘰𝘯𝘦𝘭𝘭𝘢 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢を用いた藻類致死試験により、殺藻性海洋細菌𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. Dの培養液からquestiomycin A（1）と新規化合物questiomycins C-E（2-4）を単離しました。1-4 の構造は、分光学的および分光学的データに基づいて決定しました。化合物 1 から 4 は C. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢 に対して LC₅₀値で 0.18 から 6.37 µM の殺藻活性を示しました。共培養実験により、1は微細藻類と細菌が接触したときのみ生成されることが明らかになり、微細藻類と細菌の間の何らかの相互作用がquestiomycinsの生合成の引き金となっていることが示唆されました。これらの結果から、𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. Dのような殺藻性細菌は、海洋生態系において微細藻類を化学的に制御できることが示唆されました。
    

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  背景

  • 赤潮は有害藻類ブルーム（HAB）とも呼ばれ、水産業に甚大な経済的損失を与え、沿岸環境と人間の健康を脅かしています。HABの原因として、ラフィド藻の𝘊𝘩𝘢𝘵𝘵𝘰𝘯𝘦𝘭𝘭𝘢 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢、𝘏𝘦𝘵𝘦𝘳𝘰𝘴𝘪𝘨𝘮𝘢 𝘢𝘬𝘢𝘴𝘩𝘪𝘸𝘰、渦鞭毛藻の𝘒𝘢𝘳𝘦𝘯𝘪𝘢 𝘮𝘪𝘬𝘪𝘮𝘰𝘵𝘰𝘪、𝘈𝘭𝘦𝘹𝘢𝘯𝘥𝘳𝘪𝘶𝘮 𝘵𝘢𝘮𝘢𝘳𝘦𝘯𝘴𝘦、珪藻類の𝘌𝘶𝘤𝘢𝘮𝘱𝘪𝘢 𝘻𝘰𝘥𝘪𝘢𝘤𝘶𝘴、 𝘗𝘴𝘦𝘶𝘥𝘰-𝘯𝘪𝘵𝘻𝘴𝘤𝘩𝘪𝘢 𝘢𝘶𝘴𝘵𝘳𝘢𝘭𝘪𝘴など特定の藻類が大量に繁茂していることが指摘されています。経済発展に伴う沿岸域の富栄養化がHABを増加させる大きな要因であると考えられるが、近年の気候変動は世界的にHABのリスクを高めている可能性があります。これまで、HABを抑制するために、クレイの散布や超音波照射などの化学的・物理的対策がとられてきました。これらの方法は特定の地域では有効であるが、効果、コスト、二次汚染などの問題はまだ解決されておらず、代替戦略の開発が望まれています。

    近年，微細藻類を強力に溶解する海洋細菌（殺藻性細菌）が，環境に優しいHAB対策として注目されています。藻類殺滅菌は、様々な海洋生物から分離され、その分類、分布、対象となる微細藻類などが広く研究されています。これまでに報告された殺藻性細菌の多くは、海洋環境において一般的な分類群であるProteobacteriaとBacteroidetesに属しており、殺藻性細菌が沿岸生態系のキープレーヤーの1つであることが示唆されました。 例えば、藻類殺滅菌は海草のバイオフィルムに高密度に存在することから、藻類殺滅菌は海草を介したバイオフィルムに生息し、沿岸環境へ供給されていると考えられます。殺藻性細菌は、藻類細胞を直接攻撃する方法（標的藻類細胞への付着が必要）と間接的に攻撃する方法（活性分子を放出する）があります。前者は、プロテアーゼやグリコシダーゼなどの加水分解酵素を用いて、様々な種類の微細藻類を溶解します。また、いくつかの低分子化合物も殺藻主体として同定されています。これらの分子はバクテリアから水中に放出され、分散された殺藻剤が藻類細胞を攻撃します。低分子の殺藻性化合物は、何らかの標的特異的な活性を示す傾向があります。これらの知見は、HABを軽減するための生物学的戦略の開発を促したが、多くの殺藻性細菌のメカニズムや化学的基盤は、まだ研究されていません。本研究では、初めて報告された藻類殺滅菌の一つである𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. Dから4種類のaminophenoxazinone alkaloid、questiomycins AおよびC～Eを同定しました。ここでは、questiomycins の単離、構造解明、および殺藻活性について述べます。また、藻類と細菌の密接な接触によって生じるquestiomycinsの殺藻作用の化学生態学的な根拠を提案しました。

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  精製と構造解明

  • 𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. D の培養液合計 1.6 L を逆相 C18 真空液体クロマトグラフィーで粗分離しました。70%および100%MeOH画分の間に溶出する活性分子を合わせ、Sephadex LH-20カラムでさらにクロマトグラフしました。オレンジ色のバンドを集め、逆相HPLCで精製し、主要な活性化合物としてquestiomycin A (2-aminophenoxazin-3-one, APO, (1, 図1)) を得ました。1のスペクトルデータは既報のデータとよく一致しました（表1および表2）。また、1とほぼ同じUVスペクトルと色を示す3つの新規化合物questiomycins C-E (2-4, 図1) を、追加の大規模培養からマイナーな類似体として精製しました。

    
    

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  • 図1. 海洋細菌 𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. D 由来のアミノフェノキサジノン系殺藻分子、questiomycin A（1）と新規類似体C-E（2-4）.

  • 表1. 1-4の¹H NMRデータ（δH、mult. (J in Hz）、DMSO-d₆）
    

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  • 表2. 1-4 の ¹³C NMR データ（δC, DMSO-d₆）
    

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  • questiomycin C（2）の分子式は、HR-ESI-MSのデータに基づいてC₁₃H₁₀N₂O₃Sと推論され、その値は化合物1よりもCH₂OS大きいです。2 の NMR スペクトルは 1 のそれとよく似ていたが(表1, 表2)，1 の H-1 または H-4 に対応する 2 つの芳香族プロトン一重項シグナルのうち 1 つが 2 では欠落しており，代わりに δH 2.98 にメチル一重項が観察されたことから C-1 または C-4 がmethyl sulfoxide基で置換されていると推定されました。δH 6.46 (H-4) から C-2 と C-12 への主要な HMBC 相関は、1 の H-1 が 2 のmethyl sulfoxide基で置換されていることを示していました (図 2)。methyl sulfoxideとNH₂プロトン間のNOESYクロスピークにより、 questionamycin C（2）の構造は2-amino-1-methylsulfoxy-phenoxazin-3-oneであると推定された。光学回転がないことから、2はsulfoxide基のキラル中心でラセミ体である可能性が高いことが示唆されました。

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  • 図2. questiomycin C (2) の二次元NMR data assignment
    

  • questiomycin D（3）の分子式は，HR-MSデータからC₁₃H₁₀N₂O₂S と決定され，2より酸素が1つ小さいです。また，¹H および ¹³C NMR スペクトルは 2 とほぼ同じでしたが（表 1 および表 2），メチル信号は δH 2.98/δC 39.0 から δH 2.31/δC 17.1 にシフトしていました。化学シフトの違いや分子式を考慮すると、2のmethyl sulfoxid基が3のmethyl sulfide基で置換されていることが強く示唆されました。2 次元 NMR スペクトルの HMBC および NOESY データを含む詳細な解析により、置換位置は 2 と同様に C-1 であることが判明しました。こうして、questiomycin D（3）の構造は、2-amino-1-methylthio-phenoxazin-3-oneであることが解明されました。
    questiomycinE（4）のESI-MSスペクトルでは、m/z 290.95と292.95にほぼ同じ比率の分子イオンピークを示し、臭素原子の存在が示唆されました。4の分子式は、HR-ESI-MSデータに基づいて、C₂H₇N₂O₂Br であることが明らかになりました。2次元データを含むすべてのNMRスペクトルは，メチル信号がないこと，臭素原子の遮蔽効果によりC-1のフィールドシフトが大きいことを除いて，2および3のスペクトルと非常に類似していました。以上のスペクトルデータから、questiomycin E（4）の構造は、図1に示すように、2-amino-1-bromo-phenoxazin-3-oneであると判断されました。
    questiomycin A (1) は、陸上放線菌、海洋細菌 𝘏𝘢𝘭𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. , 𝘈𝘤𝘵𝘪𝘯𝘰𝘮𝘢𝘥𝘶𝘳𝘢 sp. などの様々な細菌種から、細胞毒性および抗生物質として報告されてきた化合物です。また、化合物1は、小麦やトウモロコシなどのイネ科に属する陸上植物のアレルケミカル剤として、競合する雑草の生育を抑制することが知られています。questiomycinのコア構造である2-aminophenoxazin-3-one (APO）は、グリキサゾン、チャンドラナニマイシン、臨床で使用されている抗がん剤アクチノマイシンなど多くの生理活性二次代謝物にも見出されています。
    2-aminophenoxazin-3-one (APO) コア構造は、2 つの 𝘰-aminophenols が様々な種類の酸化酵素によって酸化的に結合することで形成されることが報告されています。そこで、 𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. D 培地に 𝘰-aminophenol を添加し、より多量のquestiomycin を得ました。その結果、化合物 1 と 4 は、それぞれ通常時の 7 倍と 158 倍の濃度で供給されました。しかし、化合物2と3は、 𝘰-aminophenol 濃縮培地にdimethylsulfideやdimethyldisulfideなどの硫黄源を添加しても、増加しませんでした。

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  生物学的活性

  • 𝘊. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢 を用いて化合物 1～4 の殺藻活性を評価しました。化合物 1 から 4 は濃度依存的に殺藻活性を示し、LC₅₀値はそれぞれ 0.64, 0.18, 6.37, 0.20 μM でした（表3）。化合物1，2，4は同等の活性を示したが，positin-1にメチルチオエーテルを有するquestiomycin D（3）は他の3つの同族体に比べて有意に低い活性でした。1の毒性は渦鞭毛藻𝘒𝘢𝘳𝘦𝘯𝘪𝘢 𝘮𝘪𝘬𝘪𝘮𝘰𝘵𝘰𝘪，珪藻𝘊𝘩𝘢𝘦𝘵𝘰𝘤𝘦𝘳𝘰𝘴 𝘥𝘪𝘥𝘺𝘮𝘶𝘴，食用赤色大藻𝘉𝘢𝘯𝘨𝘪𝘢 𝘧𝘶𝘴𝘤𝘰𝘱𝘶𝘳𝘱𝘶𝘳𝘦𝘢，ブラインシュリンプ𝘈𝘳𝘵𝘦𝘮𝘪𝘢 𝘴𝘢𝘭𝘪𝘯𝘢および淡水メダカ𝘖𝘳𝘺𝘻𝘪𝘢𝘴 sp. 4の毒性はブラインシュリンプに対しても試験されました。化合物1は，試験したすべての生物，特に微細藻類に対して毒性を示したが，多細胞性アグラや水生動物に対する毒性は低かったです（表3）。

  • 表3. 選択された微細藻類および水生生物に対するquestiomycinのLC₅₀および95％信頼区間値（μM）
    

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    ^a LC₅₀ 95%信頼区間(CI)   ^b  95%CIは、100%致死が観察されなかったため計算できない。 ^c  90%以上の藻類細胞が溶解した濃度   ᵈ半数以上の個体が溶解した濃度   ^e 0.75 と 7.5 M でそれぞれ 10/10 と 0/10 の魚が 48 時間生存した。
    

    
    

  • 4は𝘊. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢に対して高い毒性を示したが，ほぼ飽和濃度の最高濃度 (68.7 μM) で試験してもブラインシュリンプは死にませんでした（表3）。これらの結果は、questiomycinは微細藻類に対して強力な致死活性を有するが、他の水生生物に対しては毒性が低いことを示していました。興味深いことに、C-1位を臭素原子に置換しても、𝘊. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢に対する活性には影響しないが、甲殻類に対する毒性は大きく低下していました。
    

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  𝘊. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢と𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp.Dとの共培養

  • 以上の実験結果から、𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. Dの殺藻作用の少なくとも一部は、化合物1〜4に起因することが強く示唆されたが、これらの化合物は実際の海洋環境とは全く異なる培養条件で生産されたものでした。そこで、微細藻類が繁殖する環境に近い条件下で、questiomycinの生産とその殺藻作用について検証を行いました。𝘊. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢を𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. Dと共培養し、過剰な栄養分を含まない改良SWM-3培地で培養しました。植え付け2日後、ほとんどの藻類細胞は死滅し、フラスコの底に沈殿したが、D株を含まない𝘊. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢の培養物は正常な成長を示しました。

    上記の共培養培地と藻類細胞の抽出物をLC-MS分析した結果、藻類が繁殖している海水と同様の条件で、確かに化合物1が生成していることが確認されました（図3）。ただし、その計算濃度は 0.31 ng/mL (1.46 nM) であり、化合物 1 の LC₅₀ 値の約 400 倍でした。なお、この実験では他のquestiomycin 2-4 は検出されていません。藻類の初期密度や培養期間が異なるため、2つの実験における1の活性を直接比較することはできないが、濃度の大きな差は、1の作用のメカニズムに何らかの洞察を与えるものであると考えられます。

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  • 図3. D株を含まない𝘊. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢培養物（黒）、共培養物（ピンク）、questiomycin A（1）標準品（青）の抽出液のLC-MSクロマトグラム。共培養培地中の化合物 1 の計算濃度は 0.31 ng/mL であった。
    

  • そこで、上記実験におけるLC₅₀値と1の検出濃度の有意差は、𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. Dがquestiomycic以外の殺藻性物質を生産したため、あるいはD株が微細藻類に接近して1を生産し、1の局所作用により藻類細胞が溶解したためと推測されました。後者の場合，𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. Dは藻類に接触したときのみ𝘊. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢 を殺すことができるが，半透膜で藻類と分離した状態では殺すことができません。この考えを検証するため、𝘊. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢とD株を分離膜の有無にかかわらず共培養し（図4）、条件Aでは細菌と藻類が物理的・化学的に自由に接触できるのに対し、条件Bでは生物間で化学的接触のみが可能であることを確認しました。菌の接種から7日後、条件Aのウェルでは𝘊. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢の細胞はすべて溶解したが、条件Bの細胞は生存していました（図4）。LC-MS分析の結果、条件-A培地中の1の濃度は1.5 nMであり、前回の共培養実験とほぼ同じであったが、条件-B培地中の1は検出限界以下であり、分離培養ではquestiomycinが全くあるいは微量に生成されたことが示されました。
    

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  • 図4. 分離しない場合（A）とフィルターで分離した場合（B）の𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 sp. D と 𝘊. 𝘢𝘯𝘵𝘪𝘲𝘶𝘢  の共培養（ポアサイズ0.4μmの膜を使用）
    

  • これらの結果は、代替殺藻性分子の存在の可能性を否定するものではないが、貧栄養環境下で微細藻類と殺藻性細菌が物理的に接触することが、questiomycinのような殺藻性分子を生成する一つのきっかけとなり、接触した細胞を殺すには、わずかな量の殺藻化合物で十分だという考えを強く支持するものです。この仕組みは、藻類を殺す細菌にとってはコスト的に有利であり、また、環境中に広がる毒性分子が少ないため、HABの予防に利用する上でも有益であると思われます。questiomycinの殺藻活性のメカニズムや、本菌の殺藻性分子の生合成制御については、今後解明すべき興味深い問題です。また、実際の環境下におけるquestiomycinの存在と機能についても調査する必要があります。しかし、今回得られた、藻類を殺す細菌に含まれる殺藻性分子の同定は、HABで起こる化学生態学的現象のさらなる理解に大いに役立つと思われます。