精製と構造解明

Alteromonas sp. D の培養液合計 1.6 L を逆相 C18 真空液体クロマトグラフィーで粗分離しました。70%および100%MeOH画分の間に溶出する活性分子を合わせ、Sephadex LH-20カラムでさらにクロマトグラフしました。オレンジ色のバンドを集め、逆相HPLCで精製し、主要な活性化合物としてquestiomycin A (2-aminophenoxazin-3-one, APO, (1, 図1)) を得ました。1のスペクトルデータは既報のデータとよく一致しました（表1および表2）。また、1とほぼ同じUVスペクトルと色を示す3つの新規化合物questiomycins C-E (2-4, 図1) を、追加の大規模培養からマイナーな類似体として精製しました。

図1. 海洋細菌 Alteromonas sp. D 由来のアミノフェノキサジノン系殺藻分子、questiomycin A（1）と新規類似体C-E（2-4）.

表1. 1-4の¹H NMRデータ（δH、mult. (J in Hz）、DMSO-d₆）

表2. 1-4 の ¹³C NMR データ（δC, DMSO-d₆）

questiomycin C（2）の分子式は、HR-ESI-MSのデータに基づいてC₁₃H₁₀N₂O₃Sと推論され、その値は化合物1よりもCH₂OS大きいです。2 の NMR スペクトルは 1 のそれとよく似ていたが(表1, 表2)，1 の H-1 または H-4 に対応する 2 つの芳香族プロトン一重項シグナルのうち 1 つが 2 では欠落しており，代わりに δH 2.98 にメチル一重項が観察されたことから C-1 または C-4 がmethyl sulfoxide基で置換されていると推定されました。δH 6.46 (H-4) から C-2 と C-12 への主要な HMBC 相関は、1 の H-1 が 2 のmethyl sulfoxide基で置換されていることを示していました (図 2)。methyl sulfoxideとNH₂プロトン間のNOESYクロスピークにより、 questionamycin C（2）の構造は2-amino-1-methylsulfoxy-phenoxazin-3-oneであると推定された。光学回転がないことから、2はsulfoxide基のキラル中心でラセミ体である可能性が高いことが示唆されました。

図2. questiomycin C (2) の二次元NMR data assignment

questiomycin D（3）の分子式は，HR-MSデータからC₁₃H₁₀N₂O₂S と決定され，2より酸素が1つ小さいです。また，¹H および ¹³C NMR スペクトルは 2 とほぼ同じでしたが（表 1 および表 2），メチル信号は δH 2.98/δC 39.0 から δH 2.31/δC 17.1 にシフトしていました。化学シフトの違いや分子式を考慮すると、2のmethyl sulfoxid基が3のmethyl sulfide基で置換されていることが強く示唆されました。2 次元 NMR スペクトルの HMBC および NOESY データを含む詳細な解析により、置換位置は 2 と同様に C-1 であることが判明しました。こうして、questiomycin D（3）の構造は、2-amino-1-methylthio-phenoxazin-3-oneであることが解明されました。
questiomycinE（4）のESI-MSスペクトルでは、m/z 290.95と292.95にほぼ同じ比率の分子イオンピークを示し、臭素原子の存在が示唆されました。4の分子式は、HR-ESI-MSデータに基づいて、C₂H₇N₂O₂Br であることが明らかになりました。2次元データを含むすべてのNMRスペクトルは，メチル信号がないこと，臭素原子の遮蔽効果によりC-1のフィールドシフトが大きいことを除いて，2および3のスペクトルと非常に類似していました。以上のスペクトルデータから、questiomycin E（4）の構造は、図1に示すように、2-amino-1-bromo-phenoxazin-3-oneであると判断されました。
questiomycin A (1) は、陸上放線菌、海洋細菌 Halomonas sp. , Actinomadura sp. などの様々な細菌種から、細胞毒性および抗生物質として報告されてきた化合物です。また、化合物1は、小麦やトウモロコシなどのイネ科に属する陸上植物のアレルケミカル剤として、競合する雑草の生育を抑制することが知られています。questiomycinのコア構造である2-aminophenoxazin-3-one (APO）は、グリキサゾン、チャンドラナニマイシン、臨床で使用されている抗がん剤アクチノマイシンなど多くの生理活性二次代謝物にも見出されています。
2-aminophenoxazin-3-one (APO) コア構造は、2 つのo-aminophenols が様々な種類の酸化酵素によって酸化的に結合することで形成されることが報告されています。そこで、 Alteromonas sp. D 培地に o-aminophenol を添加し、より多量のquestiomycin を得ました。その結果、化合物 1 と 4 は、それぞれ通常時の 7 倍と 158 倍の濃度で供給されました。しかし、化合物2と3は、 o-aminophenol 濃縮培地にdimethylsulfideやdimethyldisulfideなどの硫黄源を添加しても、増加しませんでした。