基礎生命科学実験テキスト
โครงสร้างหัวข้อ
-
実験では、試薬や溶液の必要量を正確に量り取ったり、迅速に分注したりする技術が必要となる。ここでは、生化学や分子生物学の実験で多用されるメスピペット（1 mL）およびマイクロピペット(10、20、200、1000 mL)について使用法を学ぶ。
(1) メスピペット
先端を細く絞ったガラス管に、目盛りの付いた構造で、ホールピペットと異なり、任意の体積の液体を量り取ることが出来るが、精度はホールピペットに比較して劣る。液体を所定の体積ずつ、複数の容器に連続して分注する際などに用いると便利である。先端まで目盛りの付いた「先端目盛型」と、先端部に目盛りのない「中間目盛型」があるが（下図）、後者では、吸い上げた全量を吐き出すやり方での使用はできない。口で吸引し、人差し指で液の流出を調節するが、人体に有害な液体や、微生物の培養液等を取り扱う場合は、安全ピペッターや電動ピペッターを用いる。
体積を正確に量り取るために、標線に液面を合わせる際や、液を受器に流出させている間は、ピペットの先端を容器の内壁に接触させておかなければいけない。また、先端の欠けたピペットは使用しない。
メスピペットの取り扱い方（動画）【実験1】メスピペット(10 mL)の検定
(a) 受器として、50 mLのプラスチックチューブを電子天秤の秤量皿にのせ、TAREボタンを押して、表示をゼロにする。
(b) 受器を秤量皿から降ろし、メスピペットで純水を1.00 mL受器にとって、秤量皿にのせ、量り取った水の重量を読み取って記録する。
(c) (a)および(b)の操作を合計3回行って、平均値を求める。
(d) 5.00 mLおよび10.00 mLについても同様の測定を行う。
(e) メスピペット(10 mL)の公称誤差は、一般に±0.1 mLである。自班の測定結果はこの誤差範囲に収まっているか確認せよ。また、量り取る体積によって誤差が変化する傾向はあるか、ある場合はその要因を考察せよ。
電子天秤の使い方（動画）(2) マイクロピペット
ここでは、0.1 mLから1 mL程度の液体を量り取ることができる機械式のピペットを指す。内部にピストンとシリンダーがあり、ピストンの可動範囲を精密に調節することで、任意の体積の液体を量り取ることが出来る。先端にピペットチップと呼ばれる使い捨てのノズルを装着して用いる。極微量の液体を正確に、無駄なく取り扱えるので、分子生物学や生化学の実験で多用される。しかし、不適切な使用を行うと、内部の部品を容易に劣化させ、大きな誤差を生ずるようになる。そのような状態になっても外見は正常なので注意が必要である。また、ピペットチップより上側の部分は、洗浄せずに繰り返し使われるので、この部分を介して試料や試薬の汚染が起こりやすく、厳重な注意が必要である。
※ピペットチップより上側の部分を、容器に接触させない。
※ピペットチップより上側に、絶対に液を吸い上げない。
※先端を上に向けない。
マイクロピペットは内部に樹脂や金属製の部品があり、これらを腐食する蒸気を発する有機溶媒や、揮発性の強酸、強塩基等の取り扱いに用いてはならない。
マイクロピペットの説明（動画）
マイクロピペットの操作方法（動画）【取り扱い方】以下の下線部を守らないと、本体内部に液体を吸い上げることになります。
(a) 容量の設定
ダイアルを回し、希望の容量に合わせる。容量を増やすときは、いったんその目盛りを少し超えるまで回し、その後、希望の目盛りに合わせる。容量を減らすときは、直接その目盛りに合わせる。設定可能範囲を超えて（0 mL以下や最大容量を大きく超える容量）にダイアルを回そうとすると、破損するので、絶対にしないこと。
(b) ピペットチップをしっかりと装着する。
(c) プランジャー（ピストン）は2段階に押し込めるようになっていて（図3）親指で操作する。a→bまで押し込んだ状態で（この時絶対にcまで押し込まないこと）、量り取る液体にチップの先端を入れる（深さ1～3 mm程度；図4-①）。
(d) プランジャーを押さえる力を弱め、バネの力で、b→aまでゆっくり（重要！）戻すと設定量がチップ内に吸引される（図4-②）。
(e) 受器の内壁に、チップの先端を接触させ、プランジャーをゆっくり（特に粘度の高い液体の場合重要）a→bまで押し込んで、液体を吐き出させる（図4-③④）。
(f) ピペットチップの先端に残った液は、プランジャーをさらにcまで押し込むことで、排出させる（図4-⑤）。排出後、プランジャーを押さえる力を弱め、ゆっくりとaの位置まで戻す。この時、チップの先端は受器の液体の液面より上になければならない。
(g) ピペットチップ廃棄容器の上で、イジェクトボタンを押して、チップを取り外す。（図4-⑥）してはいけない操作の例（動画）【実験2】マイクロピペットの検定
(a) 10 mL、20 mL、200 mL、並びに1000 mLのマイクロピペットについて、【実験1】の要領で検定を行う。検定に際しては、マイクロピペットの製造番号を記録せよ。また、10 mLおよび20 mLのマイクロピペットについては、受器として0.2 mLマイクロテストチューブを用い、0.1 mgの桁まで測定できる電子天秤を使用する。また、200 mLのマイクロピペットについては、受器として1.5 mLマイクロテストチューブを使用する。いずれも、秤量に際しては、ふたを閉じること。設定容量は以下の通りとし、各容量について、3回測定し、平均値を求めよ。
Aグループ：10 mLマイクロピペット：1.0、5.0、10.0 mLBグループ：20 mLマイクロピペット：2.0、10、20.0 mL
Aグループ：200 mLマイクロピペット：20、100、200 mL
Bグループ：1000 mLマイクロピペット：100、500、1000 mL
(b) 以下（太線内）は本実験で用いるマイクロピペットの公称誤差である。自班の測定結果が公称誤差の範囲に収まっているかどうか確認せよ。
-
(1) 溶液の様々な調製法
所定の組成の溶液を再現性良く調製できることが必要である。必要とされる濃度の正確さは、使用目的によって異なる。濃度の表し方は、下記の4つがよく用いられる。
重量パーセント濃度 〇% (w/w)、〇%wt
「溶液100 gに、何グラムの溶質が溶けているか」
例）10% (w/w) 水酸化ナトリウム水溶液
〇天秤で10 gの水酸化ナトリウムを計り取り、90 g（比重を1とする場合、メスシリンダーで90mLを計り取る）の水に溶解する。
×天秤で10 gの水酸化ナトリウムを計り取り、100 mLの水に溶解する。→ 10 ÷（10＋100）×100=9.09% (w/w)の溶液になってしまう。
重量体積パーセント濃度 〇% (w/v)
「溶液100 mLに、何グラムの溶質が溶けているか」
例）5% (w/v) 塩化ナトリウム水溶液
〇天秤で5 gの塩化ナトリウムを計り取り、ビーカーで少量の水に溶解し、それを容量100 mLのメスフラスコに移して、水で100 mLにメスアップする。
△天秤で5 gの塩化ナトリウムを計り取り、100 mLの水に溶解する。→溶質を加えることで、体積が増大することを考慮していない。
体積パーセント濃度 〇% (v/v)
「溶液100 mLに何mLの溶質が溶けているか」
例） 20% (v/v)エタノール
〇メスシリンダーで20 mLのエタノールを計り取り、これを容量100 mLのメスフラスコに入れて、水を加えて100 mLにメスアップする。
×2本のメスシリンダーのそれぞれに、20 mLのエタノールと80 mLの水を取り、ビーカーに注ぎだして混合する。→ 100 mLの溶液にはならない。
モル濃度 〇M、〇mol/L
「溶液1 Lに何molの溶質が溶けているか」
例） 0.5 M 塩化ナトリウム
〇塩化ナトリウム（NaCl: 式量58.44）0.5 mol（0.5×58.44=29.22 g）を天秤で計り取り、ビーカーに移して水を加えて溶解する。これを1 Lのメスフラスコで1 Lにメスアップする。
※溶液の希釈（重量体積パーセント、体積パーセント、モル濃度の場合）
x分の一の濃度にする。→溶媒で体積をx倍にする。
例）0.5 M NaClを0.01 M NaClに希釈したい。
〇濃度を1/50にする。→0.5 M NaCl溶液10 mlを500 ml容量のメスフラスコに取り、水でメスアップする（体積を50倍にする）。
〇0.5 M NaCl溶液10 mlをメスシリンダーで計り取った490 mlの水と混合する。
(2) 緩衝作用の原理
緩衝液とはpHを一定に保つ性質を持った溶液であり、生物組織の各種の処理、細胞の培養、酵素反応、生体成分の分析など、生物学および生化学のあらゆる実験で多用される。緩衝液は、弱酸とその共役塩基、または、弱塩基とその共役酸が溶液中に共存する状態を作り出すことによって作成する。例えば、Tris-HCl緩衝液では、Tris（トリスヒドロキシメチルアミノメタンの略称）が弱塩基、それがプロトン（H+）を受け取ってできる陽イオンが共役酸である。これらが溶液中に共存する時、外部から酸が入ってきた場合、式1の反応が右向きに進行することで、水素イオン濃度の上昇が抑えられる。一方、外部から塩基が入ってきた場合には、式1の反応が左向きに進行することで、塩基を中和する。
単に、トリスを水溶液とした場合にも、式2の反応が起こって、トリスとその共役酸が共存した状態となるが、その場合は、[Tris] >> [共役酸] となり( [ ]はモル濃度を意味する)、酸に対しての緩衝作用はあるものの、塩基に対しての緩衝作用はほとんど示さない。酸、塩基両方に対しての緩衝作用が最大となるのは、[Tris] = [共役酸] のときである。そのような状態を作り出すため、ここでは、トリス水溶液にその半分程度のモル量の塩酸を加える方法で、緩衝液を作成する。
【実験3-1】 0.5 M Tris-HCl (pH 7.5) の調製
Trisと塩酸で作成した緩衝液でpHを7.5に保つ性質を持つ。Trisとその共役酸の濃度の和が0.5 Mとなる。100 mL調製する。
(a) 水に溶解して体積を100 mLとした場合に、0.5 Mとなる重量のTrisを電子天秤で薬包紙に取る（Trisの分子量は121.14）。
電子天秤の使い方（動画）
(b) 薬包紙上のTrisをすべて、100 mLビーカーに移す（薬包紙に残るTrisは洗ビンの純水を吹きかけて、ビーカーへ落とすこと）。
(c) 100 mLを超えないように純水を加え、ガラス棒で攪拌して溶解する。
(d) pHメーターを準備する（校正はpH 6.86と9.18の標準緩衝液で行う）。
(e) マグネチックスターラーで攪拌しながら、溶液のpHを測定する（塩基性を示す）。
(f) 6 M HCl（取り扱い注意）を数滴ずつ駒込ピペットで加え、pHを7.5に合わせる。
(g) 溶液をすべて100 mLメスフラスコに移す。
(h) 洗ビンの純水で100 mLにメスアップし、栓をして攪拌する。
(i) 内容物を三角フラスコに移し、密封して、冷蔵庫に保管する。
【実験3-2】 0.5 M リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.0) の調製
溶液中にH2PO4- （弱酸） とHPO42- （共役塩基）が共存することで緩衝作用を示す。
(a) 水に溶解して体積を100 mLとした場合に、0.5 Mとなる重量のリン酸二水素ナトリウム（NaH2PO4、式量119.98）を電子天秤で薬包紙に取る。
(b) 薬包紙上のリン酸二水素ナトリウムをすべて、100 mLビーカーに移す。
(c) 100 mLを超えないように純水を加え、ガラス棒で攪拌して溶解する。
(d) pHメーターを準備する（校正はpH 6.86と9.18の標準緩衝液で行う）。
(e) マグネチックスターラーで攪拌しながら、溶液のpHを測定する（酸性を示す）。
(f) 4 M NaOH（取り扱い注意）を数滴ずつ駒込ピペットで加え、pHを7.0に合わせる。
(g) 溶液をすべて100 mLメスフラスコに移す。
(h) 洗ビンの純水で100 mLにメスアップし、栓をして攪拌する。(i) 内容物を三角フラスコに移し、密封して、冷蔵庫に保管する。
【実験4】 緩衝液の緩衝作用の測定
作成したTris-HCl (pH 7.5) 緩衝液、並びに、リン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.0) に、塩酸または水酸化ナトリウム溶液を滴下し、pHの変化を観察する。ブランクテストとして、純水に対しても同様の操作を行い、結果を比較する。
(a) 0.5 Mの緩衝液を純水で希釈して20 mMの緩衝液100 mLを調製する（4.0 mLをメスピペットでメスフラスコへ取り、純水を加えて、100 mLにメスアップする）。
(b) 希釈した緩衝液のうち、80 mLをメスシリンダーでビーカーへ量り取る。
(c) pHメーターの校正を行う。
(d) マグネチックスターラーで攪拌しながら、pHを測定する（希釈前とあまり変わらないことを確認せよ）。
(e) 0.1 M HClをメスピペットで1.0 mL加え、pHを読みとって記録する(1 mL以上加えてしまった場合は、加えた体積を記録しておく)。
(f) 合計10 mLを加えるまで、(e)の操作を繰り返す。
(g) 新たに、20 mM の緩衝液を100 mL準備し、HClの代わりに0.1 M NaOHを加える測定を行う（(a)から(f)の操作を繰り返す）。
(h) 縦軸にpH、横軸に加えたHClまたはNaOHの体積を取ったグラフを作成する（図5）。
(i) 測定は、純水80 mLについても行いコントロール実験とする。
図5 滴定曲線の例
※緩衝作用が有効なpHの範囲は緩衝成分によって異なっている。従って、目的とするpHに応じて緩衝成分を選択する必要がある。
（例）
Tris：pH 7～9
リン酸二水素塩：pH 6～8
酢酸塩：pH 4～5.5
ホウ酸塩：pH 8.5～9.5
※緩衝液を希釈してもpHはあまり変化しないが、緩衝成分の濃度が高いほど緩衝能力は大きい。従って、0.5 M Tris-HClの方が20 mM Tris-HClよりも緩衝能はずっと大きい。
※生物学や生化学の実験では、緩衝液に他に成分を追加して用いることが多い。以下に例を挙げる（組成やpHは実験者によって多少異なるのが実情なので注意が必要である）。
○PBS (phosphate buffered saline)
150 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4 (pH 7.4)
リン酸二水素イオンを弱酸、リン酸水素イオンを共役塩基とした緩衝液で、イオン強度（浸透圧）を生理的条件に近づけるため、NaClを加えている。細胞を洗浄したり、回収したりする際に用いられる。
○TE buffer
10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA
DNAの溶媒として良く用いられる。EDTAはDNA分解酵素から二価金属イオンを奪って失活させる働きを持ち、DNAの分解を防ぐ。
【課題】
式1の平衡定数は、
K1 = 2.0×108
また、式3の平衡定数は、
K3 = 6.2×10-8
である。これらの値から、それぞれの緩衝液が最も高い緩衝能を示すpHを求め、各自が作成した滴定曲線上に示せ。
-
生体成分を定量する方法は各種存在するが、比色法は簡便なため、広く用いられている。ここでは、タンパク質の比色定量法であるビウレット法並びにLowry法を実施し、基本操作を習得する。
溶液が光を吸収する度合いを表す尺度を吸光度と呼び、以下の式で表される。
A = -log ( I / I0 ) = e × c × l （式4）
A： 吸光度 e： モル吸光係数
I0： 溶液に入射する光の強度 c： 溶液のモル濃度
I： 溶液を透過した光の強度 l： 溶液の光路長（光を吸収する部分の距離）
I / I0： 透過度（T）
これをランベルト－ベールの法則という。この法則は、吸光度が濃度に比例することを意味している。また、あらかじめ濃度のわかっている幾つかの標準溶液について吸光度を測定し、eを求めておけば、濃度の不明な試料の濃度を吸光度から求められることを示している。特定の波長の光について、吸光度を実測する装置が分光光度計である。ビウレット法はタンパク質の定量に広く用いられている。ペプチド結合に関わる窒素原子が強塩基性条件下でCu2+に配位結合し、赤紫色の色素を形成することを利用したものであり、アミノ酸数が3以上のペプチドまたはタンパク質であれば、その種類によらず一定の発色率を示すのが特長である。
図6 ビウレット法における発色の原理
発色はR1からR4の構造の影響を受けない
ビウレット法は、0.5から5 mg/ml程度のタンパク質濃度を測定するのに適しているが、より希薄なタンパク質溶液の濃度測定には、Lowry法が用いられる。Lowry法においては、ビウレット法と同様な原理による発色に加え、フェノール試薬中に含まれるリンモリブデン酸（リン酸とモリブデン酸の複合体）やリンタングステン酸が、タンパク質に含まれるチロシン、トリプトファン、システイン等の還元性を持ったアミノ酸によって還元され、青藍色の色素を形成することを利用している。感度はビウレット法の数十倍高いが、還元性アミノ酸の含有率はタンパク質によって異なるため、発色率がタンパク質の種類によって異なる点に注意が必要である。
ビウレット法
(1)ビウレット試薬の調製（各班で100 mL調製）
(a) 0.6 gの酒石酸ナトリウムカリウム（四水和物）を薬包紙に取り、100 mlのビーカーへ移す。薬包紙に付着した固体は洗ビンの純水でビーカーへ洗い落とす。これに純水を加えて約40 mLとし、ガラス棒で攪拌して溶解する。
(b) さらに3 gの水酸化ナトリウム（潮解性・取り扱い注意）を加えて、攪拌・溶解する。
(c) 0.15 g の硫酸銅（五水和物）を計り取り、別のビーカーで約40 mLの純水に溶解する。
(d) (c)で調製した溶液を(b)のビーカーへ加えて攪拌する（(c)のビーカーは少量の純水で洗浄して、洗液はすべて(b)のビーカーへ移すこと）。
(e) メスフラスコに移して純水で100 mLにメスアップする。
(f) プラスチック容器に移して室温保存
※試薬の溶解の順序を守らないと、溶解しにくかったり、不溶化が起こったりして失敗します。
(2)比色分析
(a) ウシ血清アルブミンを20 mM リン酸ナトリウム緩衝液に溶解した標準溶液を作成する（血清アルブミン約0.5 gを薬包紙に精秤して100 mLのビーカーへ移し、さらに、0.5 M リン酸ナトリウム (pH 7.0) 4.0 mLと純水を加えて溶解し、メスフラスコで100 mLにメスアップする。正確な濃度を計算しておく）。
(b) 5本の試験管にそれぞれ、0、0.2、0.4、0.6、1.0 mLの標準溶液をメスピペットまたはマイクロピペット(1000 mL)で取る。
(c) さらにそれぞれに、1.0、0.8、0.6、0.4、0 mLの20 mM リン酸ナトリウム (pH 7.0) （別途0.5 M溶液をメスフラスコで希釈して調製する）を加える（それぞれの試験管は、ブランクテスト、標準液の5、2.5、1.667、1倍希釈液となる）。
(d) 各試験管に4.0 mLのビウレット試薬をメスピペットで加え（安全ピペッターを使用すること）、直ちに良く振り混ぜる。
(e) 室温で30分以上放置する。
(f) 分光光度計を準備する（540nmに波長設定、0および100%透過度の校正）。
(g) 発色の弱いものから順に、ガラスセルに移して吸光度を測定する（試料を変える時は、共洗いを行う）。
(h) 縦軸に吸光度、横軸にアルブミン濃度 (mg/mL) を取ったグラフ（検量線；図7）を作成し、直線の傾きを算出する（0.05程度になるはず）。※この検量線を作成しておけば、未知試料のタンパク質濃度を求めることができる。(i) 緩衝液として、20 mM Tris-HCl (pH 7.5)を用いた測定も行い、検量線がどのように異なるか比較せよ。
図7 ビウレット法の検量線
Lowry法
(1)試薬の調製
試薬①2% Na2CO3、0.1 M NaOH
試薬②0.5% 硫酸銅（五水和物）、1% 酒石酸ナトリウムカリウム（四水和物）
（必要量の硫酸銅および酒石酸ナトリウムカリウムを別々の容器で純水に溶解し、それらをメスフラスコに移して混合すること）
試薬③測定の当日に①と②の試薬を50：1の体積比で混合したもの
フェノール試薬：市販品を純水で2倍希釈して調製したものを用いる（調製済のものを提供します）
(2)比色分析
(a) 20 mM リン酸ナトリウム (pH 7.0) に0.5 mg/mlとなるようウシ血清アルブミンを溶解した標準溶液を調製する（ビウレット法で作成した標準溶液を、メスフラスコを使用して、緩衝液で10倍希釈するとよい）。
(b) 5本の試験管に、標準溶液を0、0.2、0.4、0.6、1.0 mL取る。
(c) それぞれの試験管に20 mMリン酸ナトリウム (pH 7.0) を1.0、0.8、0.6、0.4、0 mL加える。
(d) 各試験管に試薬③を5.0 ml加え、良く攪拌する。
(e) 室温で10分以上放置する。
(f） 各試験管にフェノール試薬0.5 mlを加え、直ちに激しく攪拌する。
(g) 室温で30分以上放置した後、750 nmの吸光度を測定する。
(h) ビウレット法と同様に、タンパク質濃度と吸光度の関係を表す検量線を作成せよ。
(j) 緩衝液として、20 mM Tris-HCl (pH 7.5) を用いて結果を比較せよ。
【課題】
検量線の傾きは測定の感度を表している（傾きが大きいほど感度が高い）。傾きを算出し、Lowry法はビウレット法に比較して何倍高感度か計算せよ。
-
