海洋細菌𝘛𝘦𝘯𝘢𝘤𝘪𝘣𝘢𝘤𝘶𝘭𝘶𝘮 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮由来の直鎖状Hydroxamate Class Siderophore Bisucaberin B

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  海洋細菌𝘛𝘦𝘯𝘢𝘤𝘪𝘣𝘢𝘤𝘶𝘭𝘶𝘮 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮由来の直鎖状Hydroxamate Class Siderophore Bisucaberin B×SDGs

     
  
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  発表論文

  • 掲載誌：molecules

    （moleculesは、Creative Commons, CC BY 4.0を受けています。）
    

    
    タイトル：Bisucaberin B, a Linear Hydroxamate Class Siderophore from the Marine Bacterium 𝘛𝘦𝘯𝘢𝘤𝘪𝘣𝘢𝘤𝘶𝘭𝘶𝘮 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮

    著者：
    

    Masaki J.Fujita
    

    Koji Nakano

    Ryuichi Sakai
    

    URL：https://www.mdpi.com/1420-3049/18/4/3917/htm
    

    論文公開日：2013年4月2日

    
    
    

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  背景

  • Siderophoreは、第二鉄イオンに親和性を持ち、鉄の取り込みや輸送を担うバクテリアの産物です。鉄は，ほぼすべての生物にとって必須元素であり，様々な酵素の補酵素として機能しています。しかし、海洋環境における第二鉄イオンの生物学的利用能は低く、そのため生物生産における制限因子となっています。Siderophoreは、鉄欠乏環境におけるionophoreとしての役割に加え、細菌のケミカルコミュニケーションにおいても重要な役割を担っています。海洋環境では、一部の細菌が他の菌株が生産するSiderophoreを獲得し、自身の増殖に利用する「siderophore piracy」と呼ばれる現象が見られます。鉄をめぐる激しい競争の中で、細菌はsiderophoreの生合成や利用方法を進化させ、siderophore piracyを克服したり、特定の菌株間のケミカルコミュニケーションにsiderophoreを利用できるようになったと推測されています。

    また、siderophoreは生合成の研究においてモデル化合物としての役割を担っています。例えば、大腸菌のエンテロバクチンやコレラ菌のビブリオバクチンの研究は、非リボソームペプチド合成酵素（NRPS）の理解に寄与しています。近年、𝘕-hydroxy-𝘕-succinyl cadaverine (HSC, 6) を一般成分として含む bisucaberin  (2) やdesferrioxamine (3-5) などのsiderophoreの生合成酵素（HSC系siderophore）が、新しいクラスのアミド結合形成酵素として記載されています。HSC系siderophoreは、大環状または非環状のHSCオリゴマーに何らかの修飾を施した、あるいは施さない一連の化合物です（図1）。現在までに、様々な細菌や海洋メタゲノムから、いくつかのHSC系siderophoreの生合成遺伝子がクローニングされています。また、大腸菌を宿主としてクローニングした遺伝子群を発現させることにより、bisucaberin（2）を異種生産することが報告されています。しかし、オリゴマー化反応や大環状化反応の制御機構はまだ解明されていません。

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    図1. 大環状および非環状の𝘕-hydroxy-𝘕-succinyl cadaverine（HSC）系siderophoreとその共通モノマーHSC
    

    
    

  • 最近、我々は直鎖状HSC系siderophoreである bisucaberin Bを生産する細菌𝘛𝘦𝘯𝘢𝘤𝘪𝘣𝘢𝘤𝘶𝘭𝘶𝘮 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮を単離しました(1)。化合物1は、𝘈𝘻𝘰𝘴𝘱𝘪𝘳𝘪𝘭𝘭𝘶𝘮 𝘪𝘳𝘢𝘬𝘦𝘯𝘴𝘦を介したdesferrioxamine Bの分解産物として同定されましたが（4）、この分子の詳細な特性は報告されていませんでした。今回、我々は1が本菌由来の単一のsiderophore生成物であることを見出しました。興味深いことに、既知のHSC系siderophoreは、ほとんどが大環状か、ヒドロキシルアミノ末端にアセチルなどのモノカルボン酸がキャップされて大環状化が妨げられた直鎖状であり、遊離カルボン酸を有する直鎖状の1の単独生産は異例でした。本稿では、本菌の分離、化合物1の分析・精製・構造解明、生合成とケミカルエコロジーの観点からの考察を報告します。

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  結果と考察

  • パラオ共和国で採取された未同定の海綿からsiderophore産生菌が分離されました。16S rRNAの配列決定により、本菌はバクテロイデス門に属する𝘛𝘦𝘯𝘢𝘤𝘪𝘣𝘢𝘤𝘶𝘭𝘶𝘮 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮であると同定しました。𝘛𝘦𝘯𝘢𝘤𝘪𝘣𝘢𝘤𝘶𝘭𝘶𝘮 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮は、日本およびパラオの標本から海綿関連細菌として初めて報告されたが、siderophore産生を含む本菌の化学的特性は報告されていません。

    本菌を4日間培養した後、C18ゲルを用いて培地からsiderophoreを抽出し、ゲルに結合した物質をMeOHで溶出させました。濃縮した抽出液をC18逆相オープンカラムクロマトグラフィーで分取し、MeOH水溶液で段階的に溶出しました。10-50% aqueous MeOHで溶出したsiderophore含有画分を合わせ、水で溶出したSephadex G-10樹脂のサイズ排除クロマトグラフィーでさらに分離しました。次に、siderophore活性を示す回収画分をHPLC分離し、純物質として bisucaberin B（1）を得ました；培養液から他の活性分子は検出されませんでした（図2）。

    
    

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    図2. 𝘛. 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮培養液（上）および化合物1〜3の混合液（下）の逆相HPLCクロマトグラム。遠心分離した培養液は、事前の分画や濃縮工程を経ずに直接カラムに注入された。両サンプルに含まれるbisucaberin B (1) の同一性は、共注入により確認された。分画は2分おきに採取した。siderophore活性は、上部クロマトグラムのピーク1を含むフラクションにのみ見いだされた。
    

    
    

  • HR-ESIMSのデータから、化合物1の分子式はC₁₈H₃₄N₄O₇と推定されました。これは、もともと深海細菌𝘈𝘭𝘵𝘦𝘳𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴 𝘩𝘢𝘭𝘰𝘱𝘭𝘢𝘯𝘬𝘵𝘪𝘴から、後に𝘝𝘪𝘣𝘳𝘪𝘰 𝘴𝘢𝘭𝘮𝘰𝘯𝘪𝘤𝘪𝘥𝘢から分離された大環状HSC系siderophoreのbisucaberin（2）のH₂O単位より1大きいものです。化合物1の特徴的なプロトンNMRスペクトルは、複数のメチレン信号と1つの交換可能なプロトン信号からなり、HSC型siderophoreに属することが示唆されました（表1）。これまでに、いくつかの細菌由来の大環状HSC系siderophoreが報告されているが（図1）、そのほとんどは対称的に繰り返される2量体または3量体モチーフを持つため、単純なモノマー様の1次元NMRスペクトルを示します。一方、化合物1の13C-NMRスペクトルでは、18個の分解シグナルがすべて観測され、非対称構造であることが示唆されました。COSY, HMQC, HMBCなどの2次元NMRデータの解析により，構造中に2つの𝘕-hydroxy-𝘕-succinyl cadaverine（HSC）ユニットの存在が明らかになり， δ_H  2.99 (H2-9),  δ_H  2.29 (H2-2') ～δ_C  171.5 (C-1') の主要HMBC相関を基に，この二つのHSCモノマーがアミド結合でつながっていると決定されました。化合物1の総構造は図3に示すように解明され、すなわちbisucaberin（2）の開環型であることが判明しました。
    

    
    

  • 表1.  CD₃OD: DMSO-d₆ = 1:1 における化合物 1 の ¹H- および ¹³C-NMR データ
    

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  •  a: シグナルが重なっているため、カップリング定数は決定されていない。
    

    
    

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    図3. bisucaberin B (1) の COSY および主要な HMBC 相関関係
    

  • また、ニンヒドリン試験の結果、一級アミンの存在が確認され、提案された構造の妥当性が支持されました。さらに、トリメチルシリルジアゾメタンで処理すると、化合物1の分子量は14質量単位シフトし、メチルエステルが生成していることが示されました。これらの結果から、化合物1はbisucaberin（2）のseco-acidであることが示唆されました。

    Chrome Azurol S（CAS）アッセイを用いて，化合物1と化合物2の第二鉄イオンキレート活性を比較しました。被験物質の希釈系列（最終濃度 5 ～ 1,250 μM）を CAS アッセイ液と混合した後，630 nm の光吸収を測定しました。化合物1、2ともに濃度依存的に630 nmの吸収を減衰させ（図4）、IC₅₀値はそれぞれ55、37 μMであり、bisucaberin B（1）のキレート活性は化合物2と同程度であることが示されました。

    
    

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    図4. クロムアズールS（CAS）アッセイ結果。CAS-鉄イオン複合体の濃度を示す630 nmの吸収は、他のキレート剤との鉄の競合により減少する。各データポイントは、平均値±SDを表す（n = 6）。
    

    
    

  • Bisucaberin B (1)は、以前、desferrioxamine Bのバクテリア分解によるマイナー代謝物として報告されました(4)。今回、我々はbisucaberin B（1）が唯一のsiderophoreとしてデノボに生合成されることを初めて明らかにしました。これまでに、𝘚𝘵𝘳𝘦𝘱𝘵𝘰𝘮𝘺𝘤𝘦𝘴属、𝘗𝘴𝘦𝘶𝘥𝘰𝘮𝘰𝘯𝘢𝘴属、𝘌𝘳𝘸𝘪𝘯𝘪𝘢属、𝘝𝘪𝘣𝘳𝘪𝘰属の細菌から、3量体のアナログであるdesferrioxamine G1（5）が報告されています。しかし、ほとんどの場合、化合物5は大環状化合物3と共生成されており、化合物3の生合成中間体であると考えられています。本研究で培養液中に環状生成物の痕跡が認められなかったことは、化合物1が環状生成物の加水分解物ではなく、直鎖状の最終生成物として形成されることを強く示唆しています（図2）。

    図5に、HSC系siderophoreの一般的な生合成スキームと生合成遺伝子クラスターの構成を示します。最初の3つの酵素EnzA-Cはモノマー生成を触媒し、最後の酵素EnzDはオリゴマー化と大環状化反応の両方を触媒します。𝘛. 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮が直鎖状の二量体のみを生成し、環状生成物を生成しないことから、この株の酵素Dはモノマー間のアミド結合の生成を触媒し、大環状化を触媒しないことが示唆され、これが事実ならば、これまでに報告されていない現象です。酵素Dを他の既知の大環状化酵素と比較することで、大環状化反応の分子機構が明らかになると期待されます。オリゴマー化-大環状化機構を深く理解することで、所望のサイズと構造を持つHSCベースのsiderophoreの人工的な生産が可能になると期待されます。

    直鎖状二量体の鉄イオンキレート活性は、大環状二量体のそれと同等でした。我々は、非環状キレーターの生産は、他のバクテリアによるsiderophoreの改変行為を防ぐための対策であると仮定しています。化合物1と2のsiderophore-鉄イオン複合体のコンフォメーションは異なると予想されるため、鉄複合体化した化合物1は、外来siderophoreを改変行為する近隣の細菌が発現する化合物2の受容体に認識されない可能性があります。このように、直鎖型および環状HSC系siderophoreに対するsiderophore受容体の選択性を比較することは、化学生態学の観点から興味深いと思われます。化合物1の生合成酵素および推定受容体をコードする遺伝子のクローニングが進行中です。

    
    

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    図5. HSC系siderophore生合成の全体像と生合成遺伝子クラスターの構成。𝘛. 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮の第4の酵素は、二量体形成は触媒するが大環状体形成は触媒しないと考えられており、これまで報告されていない触媒機能である。
    

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