Topic outline
発表論文
掲載誌:marine drugs
(marine drugsは、Creative Commons, CC BY 4.0を受けています。)
タイトル:Production of Avaroferrin and Putrebactin by Heterologous Expression of a Deep-Sea Metagenomic DNA
著者:Masaki J.Fujita
Ryuichi Sakai
URL:https://www.mdpi.com/1660-3397/12/9/4799/htm
論文公開日:2014年9月12日
研究概要
メタゲノム解析は、微生物の分離や培養の工程を経ずに、環境試料から直接ゲノムDNAを取得することを可能にします。この方法は、未培養の環境微生物や海洋無脊椎動物の共生体など、ほとんどの場合、培養が困難な遺伝子プールから生合成遺伝子を単離することを容易にします。
現在、海洋天然物化学の分野では、配列に基づく方法と機能に基づく方法の2つの主要なメタゲノム解析アプローチが用いられています(図1)。配列ベース法は、保存された生合成遺伝子をターゲットとし、大規模な配列データの中から相同な配列を検索したり、PCR増幅法を用いてランダムなDNAプールから遺伝子を採掘したりする方法です。この方法は、ポリケチド、非リボソームペプチド、翻訳後修飾リボソームペプチドの生合成機構をコードするような、よく研究されている遺伝子群を含む検索に非常に有利です。近年、次世代シーケンサーの開発により、このような遺伝子を標的とした研究が目覚ましく発展しています。このため、海産無脊椎動物の様々な二次代謝産物を生産していると考えられる海洋共生細菌の膨大な生合成遺伝子群を採掘するためには、配列に基づくアプローチが標準的な手法となっています。
図1. 海洋天然物化学分野におけるメタゲノム研究の一般的なスキーム機能ベースメタゲノムアプローチでは、ランダムメタゲノムライブラリーから特定の選択方法(例えば、バイオアッセイ)を用いて生合成遺伝子を単離します。機能ベースのアプローチは、異種宿主微生物(ほとんどの場合、大腸菌)が、採用した選択法で検出可能な機能性分子を生産する能力に依存しています。したがって、最終産物を生産することができる遺伝子のみが選択されます。現在までに、この方法を用いて、海綿動物𝘏𝘢𝘭𝘪𝘤𝘩𝘰𝘯𝘥𝘳𝘪𝘢 𝘰𝘬𝘢𝘥𝘢𝘪と𝘋𝘪𝘴𝘤𝘰𝘥𝘦𝘳𝘮𝘪𝘢 𝘤𝘢𝘭𝘺𝘹から、それぞれ halichromeAとインドールポルフィリンハイブリッドなど、いくつかの海洋メタゲノム産物が異種生産されています。
我々はこれまでに、機能性メタゲノムアプローチと海洋試料を用いて、ポリカルボキシレート型siderophoreであるビブリオフェリンやヒドロキサメート型siderophoreの bisucaberin (2)、後者は𝘕-hydroxy-𝘕-succinyl cadaverine(4、HSC、図2)の大環状二量体であるなど、いくつかのシデロフォアの生産を行っています。最近、我々はメタゲノムDNAにコードされる bisucaberin (2)生合成酵素MbsA、B、Cの基質選択性が予想以上に広いことを見出しました。 bisucaberin (2)前駆体HSC(4)ともう一つの前駆体と考えられる𝘕-hydroxy-𝘕-succinyl putrescine(HSP、5)が𝘮𝘣𝘴𝘈-𝘊クローンの培養液中に検出され、追加生成物の存在が示唆されているからです。このように、1つの遺伝子セットから多様な分子を生産できる海洋メタゲノムの拡張性に興味を持ちました。ここでは、メタゲノムクローンの代謝物を詳細に解析し、他の海洋細菌の関連生合成酵素と触媒機能を比較した結果を報告します。この結果は、海洋メタゲノムが潜在的に持つ多様性と、機能未知の遺伝子を解析する機能ベースアプローチの有用性を示すものです。
図2. 𝘕-hydroxy-𝘕-succinyl diamine(HSD)系siderophoreの構造
研究成果
トカラ列島沖で採取された深海底堆積物から得られたメタゲノムライブラリーから、 siderophore であるbisucaberin(2)の生合成酵素をコードする遺伝子群(𝘮𝘣𝘴𝘈-𝘋)をクローニングしました。以前の研究では、この培養クローンからHSC(4)二量体である2が唯一の生成物として単離されたことを報告しました。しかし、その後、MbsA, B, Cは、HSC (4) だけでなく、HSP (5) も供給することができることが判明しました。この結果は、HSP (5)を前駆体として含む他の大環状体も同じ遺伝子セットから生合成される可能性を示唆するものでした。この可能性を調べるために、再び生合成遺伝子群𝘮𝘣𝘴𝘈-𝘋を大腸菌で発現させ、培養ブロスをLC-MSで分析しました(図3a)。その結果、期待される主要産物である2だけでなく、putrebactin(3;m/z 373) 、avaroferrin(1;m/z 387;HSC(4)とHSP(5)の二量体)、bisucaberin B(7;m/z 419) 、さらに3種類の推定線状中間体(6a、6b [m/z 405] および 8 [m/z 391] )が検出されました。大環状化合物 2 と 3 は数十年前に海洋バクテリアから単離されたことが報告されているが 、化合物 1 はこの原稿の準備中に培養海洋バクテリア 𝘚𝘩𝘦𝘸𝘢𝘯𝘦𝘭𝘭𝘢 𝘢𝘭𝘨𝘢𝘦 B516 からつい最近単離されました。化合物 1 と 3 は HPLC で精製され、スペクトル分析により構造が明確に確認されました。また、𝘔𝘣𝘴𝘈-𝘋 をコードする深海メタゲノムクローンは、avaroferrin(1)生合成酵素のクラスターとして、これまでに実験的に確認された最初のものです。
avaroferrin (1) は 𝘝𝘪𝘣𝘳𝘪𝘰 𝘢𝘭𝘨𝘪𝘯𝘰𝘭𝘺𝘵𝘪𝘤𝘶𝘴 B522 の群れを抑制することが報告されています。前回の研究では、同じメタゲノミッククラスターから2が単独で分離されたことを報告しました。しかし、今回の結果は、この遺伝子セットが複数のsiderophoreを産生できることを明確に示しています。これらの結果の違いは、単離・検出方法の違いによるところが大きいです。つまり、前回は2を単に再結晶で精製したが、今回は酵素の多様な性質を明らかにするために、LC-MSを利用して遺伝子産物を徹底的に調べたのです。クロムアズールS滴定法で測定した化合物1〜3の鉄イオンキレート活性は同程度であり(EC₅₀値。4.0, 3.5, 4.8 μM)、3 種類の化合物はいずれも元の生産者の鉄イオン獲得剤として機能することが示唆されました。
図3. 海洋メタゲノム由来𝘮𝘣𝘴𝘈-𝘋クローン(a)、融合遺伝子クラスタークローン(b,c)、 𝘚𝘩𝘦𝘸𝘢𝘯𝘦𝘭𝘭𝘢 𝘢𝘭𝘨𝘢𝘦 NBRC103173(d)の培養ブロスの選択イオンカレントLC-MSクロマトグラム今回の結果は、𝘕-hydroxy-𝘕-succinyl diamine(HSD)系siderophoreの生合成に関わる酵素の機能について、いくつかの示唆を与えるものです。これまで提唱されてきたHSD型siderophoreの生合成経路では、最初の3つの酵素A-Cが、リジンとオルニチンからHSDにつながる反応を次々と触媒しています。その後、第4の酵素DがHSDのオリゴマー化と最終的な大環状化の両方を触媒します。大腸菌にクローニングされたMbsA-D酵素セットは、環状生成物1-3と直鎖状中間体6-8を同時に生成したという事実は、MbsDが4と5の両方を即時型前駆体として利用し、ホモおよびヘテロ重合的にそれらを縮合できることを強く示唆するものでした。この仮説を検証するために、siderophore産生海洋細菌𝘈𝘭𝘪𝘪𝘷𝘪𝘣𝘳𝘪𝘰 𝘴𝘢𝘭𝘮𝘰𝘯𝘪𝘤𝘪𝘥𝘢 LFI1238と𝘚𝘩𝘦𝘸𝘢𝘯𝘦𝘭𝘭𝘢 sp. MR-4の2および3の生合成系から、それぞれ𝘮𝘣𝘴𝘋に相当する縮合酵素をコードする𝘮𝘣𝘴𝘈-𝘊と𝘣𝘪𝘣CCまたは𝘱𝘶𝘣𝘊からなる二つの融合遺伝子セットを作成しました。これらのキメラ遺伝子クラスターは、メタゲノム MbsA-C 酵素が共通モノマー 4 と 5 を供給するのに対し、第4の酵素は異種宿主で発現するとモノマーのオリゴマー化およびマクロシクリル化を触媒するため、機能試験が可能でした。
図4. HSD系siderophoreの生合成の一般的なスキーム(a)とその生合成遺伝子群の構成(b)。メタゲノム由来の𝘮𝘣𝘴𝘈-𝘊と他由来の𝘨𝘦𝘯𝘦𝘴 𝘋を含む融合遺伝子群システムも示している(c)コドンを最適化した𝘣𝘪𝘣CCと𝘱𝘶𝘣𝘊遺伝子を化学合成し、カセット法を用いて𝘮𝘣𝘴𝘊の下流に挿入しました(図4c)。これらの融合遺伝子クラスターの形質転換体を培養し、その上清をLC-MS分析に供しました(図3b,c)。bibCCを含むクローンは、化合物1と2、および少量の3を2:2:1の割合で生産しました。しかし、このクローンの主要な代謝産物は、非環状中間体(化合物6〜8)でした。特に、bisucaberin B(7)の蓄積量は、大環状化合物である2の6倍でした。これらの結果から、𝘉𝘪𝘣CCはアバロフェリン(1)やプトレバクチン(3)も生産できるが、その大環状化活性は、少なくとも異種宿主大腸菌ではMbsDほど強力でないことが示唆されました。𝘱𝘶𝘣𝘊クローンの場合、最も多く生産されるsiderophoreはプトレバクチン(3)であり、未知のバックグラウンドピークを除けば、他の代謝物はLC-MSクロマトグラムで検出可能な量ではありませんでした。この場合の全体のsiderophore生産量は𝘮𝘣𝘴𝘋や𝘣𝘪𝘣𝘊𝘊クローンのそれと比べて3%程度であり、PubCが本来持つ機能が異種宿主で発現していないことが示唆されました。
また、同じくアバロフェリン(1)生産菌である𝘚𝘩𝘦𝘸𝘢𝘯𝘦𝘭𝘭𝘢 𝘢𝘭𝘨𝘢𝘦 NBRC103173株のsiderophoreも解析しました(図3d)。興味深いことに、この 𝘚. 𝘢𝘭𝘨𝘢𝘦 株は主にbisucaberin(2)と少量のアバロフェリン(1)を生産し、検出可能な量の 3 を生産しませんでした。この生産パターンは、化合物 1-3 を 1:2:1 の割合で生産する 𝘚. 𝘢𝘭𝘨𝘢𝘦 株 B516 の報告とはかなり異なっていた。培養条件は完全に同じではないが、生産プロファイルの大きな違いから判断して、これらの酵素セットは同一種内でも代謝の多様性を持たせる鍵の一つとなり得ることが示唆されます。
検討した3つの縮合酵素、MbsD、BibCC、PubCのアミノ酸配列の同一性は約60%であるが、どのアミノ酸残基が酵素機能の違いに関与しているかは不明です。また、酵素によるオリゴマー化反応やマクロシクリル化反応の分子機構もほとんど分かっていません。これらの酵素や関連する他の生合成経路の構造生物学的な解析が進行中です。
本研究では、1つの酵素系で複数のsiderophoreを生産することを実証し、HSD系siderophore生合成酵素の驚くべき汎用性を明らかにしました。これらの酵素のユニークな特性は、競争的な微生物群における生産者にとって有利に働く可能性があります。例えば、ビブリオ属細菌の中には、siderophore特異的受容体を発現することにより、他の細菌が産生する外来siderophoreを利用するものが知られています。この現象は𝘴𝘪𝘥𝘦𝘳𝘰𝘱𝘩𝘰𝘳𝘦 𝘱𝘪𝘳𝘢𝘤𝘺と呼ばれ、構造的に関連する siderophore1〜3の生態学的機能の個別の違いを説明すると思われます。𝘝. 𝘢𝘭𝘨𝘪𝘯𝘰𝘭𝘺𝘵𝘪𝘤𝘶𝘴 B522は、特定の受容体を用いて2と3(ただし1ではない)を「盗む」ことができます(siderophore uptake system)。したがって、複数の siderophoreを生産する能力は、 siderophoreの海賊行為を回避する戦略を表している可能性があります。本研究は、 siderophore生合成遺伝子の配列をわずかに変えるだけで、酵素の性質が大きく変化し、その結果、 siderophore生産に大きな影響を与えることを実証しています。
𝘮𝘣𝘴𝘈-𝘋 metagenomic siderophore生合成遺伝子群は、𝘚. 𝘢𝘭𝘨𝘢𝘦 B516由来の推定アバロフェリン(1)生合成遺伝子群との配列類似性から、𝘚𝘩𝘦𝘸𝘢𝘯𝘦𝘭𝘭𝘢 sp.または関連株のものと共通の祖先を持つ可能性があります。しかし、培養可能な細菌からこれまでに分離された他の関連酵素と比較して、𝘮𝘣𝘴𝘈-𝘋クラスターの触媒機能が明らかに異なることは、環境ゲノムの全く予期しない機能の発見をもたらすかもしれない、機能ベースのメタゲノム解析アプローチの威力を示している。