Topic outline
発表論文
掲載誌：marine drugs
（marine drugsは、Creative Commons, CC BY 4.0を受けています。）
タイトル：Cloning of the Bisucaberin B Biosynthetic Gene Cluster from the Marine Bacterium 𝘛𝘦𝘯𝘢𝘤𝘪𝘣𝘢𝘤𝘶𝘭𝘶𝘮 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮, and Heterologous Production of Bisucaberin B
著者：
Masaki J.Fujita
Yusuke Goto
Ryuichi Sakai
URL：https://www.mdpi.com/1660-3397/16/9/342/htm
論文公開日：2018年9月19日
概要
N-hydroxy-N-succinyl diamine（HSD）系siderophoreであるbisucaberin B（1、bsb遺伝子群）の生合成遺伝子群を、海綿由来の海洋細菌 𝘛𝘦𝘯𝘢𝘤𝘪𝘣𝘢𝘤𝘶𝘭𝘶𝘮 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮からクローン作成しました。bsb遺伝子群は6つのopen reading frames（ORF）からなり、関連分子の生合成遺伝子群では通常4つのORFが存在するのに対し、bsb遺伝子群は6つのORFからなります。これまで、大環状化合物を生成する関連酵素は数多く報告されているが、HSD型siderophore生合成酵素が大環状化合物ではなく、直鎖状分子のみを生成する例は、本研究が初です。
背景
Siderophoreは、鉄イオンを強くキレートする微生物産物で、鉄欠乏環境下での鉄の獲得を容易にする。鉄はほぼ全ての生物の生育に必須であり、生物生産における重要な制限因子であるため、微生物は様々なSiderophoreを利用して鉄を獲得しています。また、一部の細菌は外来性のSiderophoreを自らの増殖のために利用することが報告されており、これは「siderophore piracy」と呼ばれています。最近、海洋細菌の産生するHSD（N-hydroxy-N-succinyl diamine）ベースのsiderophoreであるavaroferrin（3）が、競合する細菌の群れを停止させることが明らかにされた。これらの結果は、siderophoreが環境微生物間の複雑なケミカルコミュニケーションに寄与していることを示唆しています。
Desferrioxamineとその関連分子（1-8）は、主にN-hydroxy-N-succinyl cadaverine（HSC、9）とN-hydroxy-N-succinyl putrescine（HSP、10）のサブユニットからなる代表的なbacterial siderophoreで、様々な細菌門から分離されています（図1）。Desferrioxamine B (7) は、鉄中毒の治療薬として臨床的に使用されており、この分子群には、mycobacteriumのバイオフィルム形成の阻害やマクロファージによる癌細胞の細胞溶解の促進など、興味深い生物活性が報告されています。
図1. 様々な細菌門が生産する代表的なN-hydroxy-N-succinyl diamine（HSD）系siderophore（1-8）、およびその単量体前駆体N-hydroxy-N-succinyl cadaverineとN-hydroxy-N-succinyl putrescin（それぞれ9と10）の構造。化合物2-5および8は環状二量体および三量体であり、1および6はそれぞれ直鎖状二量体および三量体である。化合物7は擬似3量体であり、その末端の1つは酢酸基でキャップされていた。
現在までに、HSD系siderophoreの生合成を担う遺伝子クラスターがいくつかクローン作成されています。これらのクラスターは一般に4つのタンパク質をコードしており、最初の3つの酵素（酵素A〜C）は、アミノ酸（リジンおよびオルニチン）から、脱炭酸、N-水酸化、 succinyl-CoAとの縮合を順次行って共通の主要中間体であるHSDs（9および10）の生成を触媒しています。第4の酵素（酵素D）は、HSDモノマー間の複数のアミド結合の形成（9, 10）を触媒し、その後のhead-to-tail環化反応によって、最終的な大環状生成物を得ます（図2）。これらのアミド結合形成酵素（酵素Ds）は、非リボソーム型ペプチド合成酵素の新しいグループを構成しています。また、酵素Dsは幅広いHSDを基質として受け入れ、多様な生理活性を有する大環状最終生成物を生成することが報告されているが、オリゴマー化反応や大環状化反応の制御の分子機構はほとんど分かっていません。
図2. N-hydroxy-N-succinyl diamine（HSD）系siderophoreの推定生合成経路と、典型的な生合成遺伝子群の模式的構成
海洋細菌の新規 siderophore探索の過程で、パラオの未同定海綿から分離したBacteroidetes門に属する海洋細菌 𝘛𝘦𝘯𝘢𝘤𝘪𝘣𝘢𝘤𝘶𝘭𝘶𝘮 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮が、HSD系の直鎖型siderophore bisucaberin Bのみを生産し（1）、大環状の対応物は生産しないことを発見しました（2）。これまで報告されている他の細菌は主に大環状体を生産しており、直鎖状分子は生合成の中間体か shunt副産物であると考えられています（図2）。これらのことから、𝘛. 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮はHSDを基盤としたsiderophore生合成装置の最初の例であり、最終的な大環状化活性を本質的に持たない装置をコードしている可能性が示唆されました。そこで、𝘛. 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮由来の酵素を詳細に解析することで、大環状化反応の分子機構に関する情報が得られると期待されます。ここでは、𝘛. 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮由来の bisucaberin B（1）の生合成遺伝子群のクローン作成、異種発現による酵素機能の確認、およびクローン作成した酵素の簡単な逐次解析について報告します。
Bisucaberin B生合成遺伝子群のクローン作成
Bacteroidetes門からはHSD型siderophore生合成遺伝子は報告されていないが、多様な細菌分類群のアミド結合形成酵素（酵素Ds）の間で高度に保存されたアミノ酸配列を利用して、保存部分を縮退プライマーセットを用いたPCR増幅によりクローン作成しました。𝘛. 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮のゲノムDNAから増幅したDNA断片は、既知の生合成遺伝子と高い類似性を示し、本種に類似の遺伝子クラスターが存在することが示唆されました。そこで、𝘛. 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮のゲノムライブラリー（約9.6×10⁴個のフォスミドクローンから成る）をPCR増幅スクリーニング法によりスクリーニングし、全遺伝子クラスターを含むクローンを同定しました。ヒットしたクローンのショットガンシーケンスを行った結果、推定bisucaberin B（1）生合成酵素をコードする遺伝子クラスター（全長8840bp）が存在し、𝘣𝘴𝘣（bisucaberin B）クラスターと名付けられました（図3、表1；受入番号LC090204）。このクラスターには、これまでに報告されている関連生合成遺伝子クラスターで一般的に見られる4つの遺伝子（𝘈〜𝘋）ではなく、6つのオープンリーディングフレーム（ORF：𝘣𝘴𝘣𝘈、𝘉、𝘊𝘋1、𝘊2、𝘋2、𝘌）が含まれていました。
図3. Bacteroidetes門に属する海洋細菌𝘛. 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮由来のbisucaberin B生合成遺伝子群（𝘣𝘴𝘣クラスター）の構成図
表1. Bisucaberin B（1）生合成酵素
¹ N末端 204 aa、² C末端 606 aa、³bisucaberin（2）生合成の対応する酵素（MbsA-D）と配列の同一性を比較したところ、MbsA-Dは、bisucaberin（2）生合成の対応する酵素であることがわかった。
最初の2つの遺伝子、𝘣𝘴𝘣𝘈と𝘣𝘴𝘣𝘉は、それぞれ2,4-ジアミノブチル酸脱炭酸酵素とl-リジン-6モノオキシゲナーゼに高い配列相同性を有する酵素をコードしています。この2つの酵素は、リジンの脱炭酸とN-水酸化によって生成される共通の中間体、N-ヒドロキシ-1,5-ジアミノペンタンの生成に関与しています（図2）。3番目の遺伝子𝘣𝘴𝘣𝘌は、膜輸送体タンパク質の一種であるMFS (Major Facilitator Superfamily) タンパク質をコードしています。このタイプの遺伝子は、他の既知のHSDベースのシデロフォア生合成遺伝子クラスターでは見つかっていません。MFSファミリーの主な機能の一つは、抗生物質などの小分子の輸送／輸出であり、それによって薬剤耐性に寄与しています。そこで我々は、BsbEが化合物1の細胞外への分泌を促進している可能性が高いと推測しました。
𝘣𝘴𝘣クラスターと関連クラスターとの最も顕著な違いは、遺伝子𝘊と𝘋に対応するDNA配列の冗長性です。表1に示すように、𝘣𝘴𝘣クラスターにはアシル基転移酵素（酵素C）とアミド結合形成酵素（酵素D）に相同性を示す2組のオーソログが存在します。特に、1組のオーソログは、N末端（204アミノ酸残基）とC末端（606アミノ酸残基）の異なるドメインからなる推定二機能性酵素（BsbCD1）をコードする単一のキメラORFを形成し、それぞれアシル基転移酵素（BsbC1部分、緑で示す）およびアミド結合生成酵素（BsbD1部分、紫で示す）と相同性を示します（図3および表1）。BsbC1部分とBsbC2部分の配列の同一性は44%であり、両酵素は海洋メタゲノム由来の bisucaberin（2）生合成遺伝子群がコードする対応酵素、MbsCと32%の同一性を有していました。アミド結合形成酵素と推定されるBsbD1部分とBsbD2部分のアミノ酸の同一性は50%であり、これらの酵素はMbsDとそれぞれ42%と46%の同一性を示しました（表1）。したがって、BsbCD1とBsbC2-D2のセットはいずれも化合物1の生合成の候補酵素であるが、1の構造と生合成スキーム（図1、図2）を考慮すると、1の生産には1セットの酵素CとDのみが必要であると考えられます。さらに、他の関連する大環状分子の生合成では、単一の酵素Dsが複数のアミド結合形成を触媒することが報告されています（図2）。したがって、このクラスターに含まれる遺伝子𝘊と𝘋の冗長性が特に注目されます。
融合遺伝子クラスター系による Bisucaberin Bの異種混合生産
冗長性のある生合成遺伝子群をさらに深く理解するために、我々が以前開発した融合遺伝子クラスター系を用いて、推定アミド結合形成酵素であるBsbD1部分とBsbD2の機能を異種発現で評価しました（図4）。この系では、もともと海洋メタゲノムからbisucaberin（2）生合成遺伝子としてクローン作成された 3 遺伝子（𝘮𝘣𝘴𝘈-𝘊）を、カセット法による遺伝子 𝘋 挿入が可能な SalI-ApaI クローニングサイトで結合させました。コードされた酵素（MbsA-C）は重要な前駆体HSC（9）を供給するため、遺伝子𝘋の挿入により、挿入された遺伝子𝘋sの触媒特性に応じて、HSD系siderophoreの生成に向けた反応がさらに進行することになります（図2）。大腸菌での発現に最適な配列を持つ𝘣𝘴𝘣𝘋1部分と𝘣𝘴𝘣𝘋2の人工遺伝子を合成し、それぞれを融合遺伝子群系にライゲートしてp𝘣𝘴𝘣𝘋1 (mbsA-C + bsbD1 part) とp𝘣𝘴𝘣𝘋2 (mbsA-C + bsbD2) を形成しました（図4）。これらのコンストラクトを別々にまたは同時にコンピテント大腸菌に形質転換し、合計3つのクローンを調製しました。そのうちの2つはp𝘣𝘴𝘣𝘋1部分またはp𝘣𝘴𝘣𝘋2のいずれかを有する単一形質転換体、もう1つは両方のプラスミドを含む二重形質転換体です。
図4. 𝘮𝘣𝘴𝘈-𝘊と𝘣𝘴𝘣𝘋1部分または𝘣𝘴𝘣𝘋2からなる融合遺伝子クラスターの構築
siderophore産生は、Chrome Azurol S （CAS）試験および質量分析計（MS）検出器付き高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によりモニターしました。CAS試験では、p𝘣𝘴𝘣𝘋2クローンおよび二重形質転換体の培養液からsiderophore活性が検出されたが、p𝘣𝘴𝘣𝘋1クローンの培養液からは検出されませんでした。LC-MS 分析により、CAS 活性培養ブロス中にのみ bisucaberin B (1) の存在が確認され（図 5）、活性誘導単離と NMR 分析により CAS 活性生成物が bisucaberin B (1) であることが明確になりました。p𝘣𝘴𝘣𝘋2 クローンによる化合物 1 の生産量は LC-MS で 16.1 mg/L であり、本来の生産者である 𝘛. 𝘮𝘦𝘴𝘰𝘱𝘩𝘪𝘭𝘶𝘮 （38.9 mg/L） と同程度でした。二重形質転換により、1の生産量はp𝘣𝘴𝘣𝘋2単一形質転換体の約30%に減少しました（図5）。これは、活性型BsbD2部分と不活性型BsbD1部分が競合的に発現するためと思われます。大環状二量体bisucaberin（2）および三量体デスフェリオキサミンE（8）は、いずれの形質転換体の培養ブロスからも検出されませんでした（図5）。また、他の直鎖状siderophore候補であるdesferrioxamine G（6）およびB（7）も、どのクローンからも検出されませんでした。以上の結果から、BsbD2がBsbD1部分などの他の因子によらず、効率よく独占的に化合物1を生産することから、BsbD2は1の生合成におけるアミド結合形成の単一の鍵酵素であるが、大環状化機能は有していないことが明らかとなりました。
図5. 各クローンの培養液と標準物質の混合物（化合物1、2、8）のイオンカレントクロマトグラム
今回の実験ではBsbD1部分の機能を証明することはできなかったが、以上の結果から、本システムでは𝘣𝘴𝘣𝘋1部分が効率的・機能的に発現していないか、コードされているタンパク質であるBsbD1部分が本質的に不活性であることが示唆されました。
現在までに、HSD (9, 10) ベースのsiderophoreの生産を担ういくつかのアミド結合形成性大環状化酵素（酵素Ds）が、様々な細菌種から実験的に特徴付けられている（例えば、 desferrioxamine E (8) 合成酵素 DesD と DfoCC は 𝘚𝘵𝘳𝘦𝘱𝘵𝘰𝘮𝘺𝘤𝘦𝘴 𝘤𝘰𝘦𝘭𝘪𝘤𝘰𝘭𝘰𝘳 と 𝘌𝘳𝘸𝘪𝘯𝘪𝘢 𝘢𝘮𝘺𝘭𝘰𝘷𝘰𝘳𝘢 から、 bisucaberin (2) 合成酵素 BibCC と MbsD は 𝘈𝘭𝘪𝘪𝘷𝘪𝘣𝘳𝘪𝘰 𝘴𝘢𝘭𝘮𝘰𝘯𝘪𝘤𝘪𝘥𝘢 と marine metagenome から、プトレバクチン (4) 合成酵素 PubC は 𝘚𝘩𝘦𝘸𝘢𝘯𝘦𝘭𝘭𝘢 sp から、 アルカリギン (5) 合成酵素 AlcC は 𝘉𝘰𝘳𝘥𝘦𝘵𝘦𝘭𝘭𝘢 𝘱𝘦𝘳𝘵𝘶𝘴𝘴𝘪𝘴 から、それぞれ同定 (表 2)）。本研究では、BsbD2が大環状化能を持たない酵素Dの最初の例であることを証明しました。したがって、BsbD2の塩基配列を解析することで、このほとんど知られていない酵素の分子基盤が明らかになると期待されました。表2. 酵素D間の配列同一性/類似性
- 括弧内は主要製品、数値は％。
既知の酵素Dの長さは、それぞれ約630残基です。ファミリー間のアミノ酸配列の全体的な同一性は約50%であり（表2）、BsbD2も他の酵素と同様の同一性/類似性を有していました。6種類の酵素（BsbD1部分と合わせて）の系統解析の結果、最終生成物と酵素配列の間に相関があることが分かりました（図6）。得られた系統において、酵素は以下のように3つのクレードに分類されました。クレード I は、MbsD、 BibCC、PubC などの大環状二量体（2 および 4）産生酵素から構成されます。クレード IIは、DfoCCとDesDを含む大環状3量体を形成する酵素のグループです。BsbD2がこのクレードに属することから、クレードIIIは線状分子のみを生成する酵素群である可能性があります。
図6. アミド結合形成酵素のneighbor-joining法による系統解析。括弧内の数字は各酵素の主要な最終生成物を示す。
BsbD2が属するクレードIIIは、他の大環状体形成酵素を含むクレードと明確に分離されていました。これらの結果から、直鎖状分子形成酵素は他の大環状分子形成酵素と逐次的に区別できることが示唆されました。しかし、BsbD2や同じクレードに属する他のタンパク質では、それぞれの機能を担う連続的な特徴や特徴的なアミノ酸残基を同定することはできませんでした。今後、BsbD1, BsbD2の変異体やホモログを異種発現させることにより、クレードIII 酵素の配列と機能の関係を明らかにする予定です。
