融合遺伝子クラスター系による Bisucaberin Bの異種混合生産

冗長性のある生合成遺伝子群をさらに深く理解するために、我々が以前開発した融合遺伝子クラスター系を用いて、推定アミド結合形成酵素であるBsbD1部分とBsbD2の機能を異種発現で評価しました（図4）。この系では、もともと海洋メタゲノムからbisucaberin（2）生合成遺伝子としてクローン作成された 3 遺伝子（mbsA–C）を、カセット法による遺伝子 ? 挿入が可能な SalI-ApaI クローニングサイトで結合させました。コードされた酵素（MbsA-C）は重要な前駆体HSC（9）を供給するため、遺伝子Dの挿入により、挿入された遺伝子Dsの触媒特性に応じて、HSD系siderophoreの生成に向けた反応がさらに進行することになります（図2）。大腸菌での発現に最適な配列を持つbsbD1部分とbsbD2の人工遺伝子を合成し、それぞれを融合遺伝子群系にライゲートしてpbsbD1 (mbsA-C + bsbD1 part) とpbsbD2 (mbsA-C + bsbD2) を形成しました（図4）。これらのコンストラクトを別々にまたは同時にコンピテント大腸菌に形質転換し、合計3つのクローンを調製しました。そのうちの2つはpbsbD1部分またはpbsbD2のいずれかを有する単一形質転換体、もう1つは両方のプラスミドを含む二重形質転換体です。

図4. mbsA–CとbsbD1部分またはbsbD2からなる融合遺伝子クラスターの構築

siderophore産生は、Chrome Azurol S （CAS）試験および質量分析計（MS）検出器付き高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によりモニターしました。CAS試験では、pbsbD2クローンおよび二重形質転換体の培養液からsiderophore活性が検出されたが、pbsbD1クローンの培養液からは検出されませんでした。LC-MS 分析により、CAS 活性培養ブロス中にのみ bisucaberin B (1) の存在が確認され（図 5）、活性誘導単離と NMR 分析により CAS 活性生成物が bisucaberin B (1) であることが明確になりました。pbsbD2 クローンによる化合物 1 の生産量は LC-MS で 16.1 mg/L であり、本来の生産者である T. mesophilum （38.9 mg/L） と同程度でした。二重形質転換により、1の生産量はpbsbD2単一形質転換体の約30%に減少しました（図5）。これは、活性型BsbD2部分と不活性型BsbD1部分が競合的に発現するためと思われます。大環状二量体bisucaberin（2）および三量体デスフェリオキサミンE（8）は、いずれの形質転換体の培養ブロスからも検出されませんでした（図5）。また、他の直鎖状siderophore候補であるdesferrioxamine G（6）およびB（7）も、どのクローンからも検出されませんでした。以上の結果から、BsbD2がBsbD1部分などの他の因子によらず、効率よく独占的に化合物1を生産することから、BsbD2は1の生合成におけるアミド結合形成の単一の鍵酵素であるが、大環状化機能は有していないことが明らかとなりました。

図5. 各クローンの培養液と標準物質の混合物（化合物1、2、8）のイオンカレントクロマトグラム

今回の実験ではBsbD1部分の機能を証明することはできなかったが、以上の結果から、本システムではbsbD1部分が効率的・機能的に発現していないか、コードされているタンパク質であるBsbD1部分が本質的に不活性であることが示唆されました。
現在までに、HSD (9, 10) ベースのsiderophoreの生産を担ういくつかのアミド結合形成性大環状化酵素（酵素Ds）が、様々な細菌種から実験的に特徴付けられている（例えば、 desferrioxamine E (8) 合成酵素 DesD と DfoC^C は Streptomyces coelicolor と Erwinia amylovora から、 bisucaberin (2) 合成酵素 BibC^C と MbsD は Aliivibrio salmonicida と marine metagenome から、プトレバクチン (4) 合成酵素 PubC は Shewanella sp から、 アルカリギン (5) 合成酵素 AlcC はBordetella pertussisから、それぞれ同定　(表 2)）。本研究では、BsbD2が大環状化能を持たない酵素Dの最初の例であることを証明しました。したがって、BsbD2の塩基配列を解析することで、このほとんど知られていない酵素の分子基盤が明らかになると期待されました。

表2. 酵素D間の配列同一性/類似性

既知の酵素Dの長さは、それぞれ約630残基です。ファミリー間のアミノ酸配列の全体的な同一性は約50%であり（表2）、BsbD2も他の酵素と同様の同一性/類似性を有していました。6種類の酵素（BsbD1部分と合わせて）の系統解析の結果、最終生成物と酵素配列の間に相関があることが分かりました（図6）。得られた系統において、酵素は以下のように3つのクレードに分類されました。クレード I は、MbsD、 BibC^C、PubC などの大環状二量体（2 および 4）産生酵素から構成されます。クレード IIは、DfoC^CとDesDを含む大環状3量体を形成する酵素のグループです。BsbD2がこのクレードに属することから、クレードIIIは線状分子のみを生成する酵素群である可能性があります。

図6. アミド結合形成酵素のneighbor-joining法による系統解析。括弧内の数字は各酵素の主要な最終生成物を示す。

BsbD2が属するクレードIIIは、他の大環状体形成酵素を含むクレードと明確に分離されていました。これらの結果から、直鎖状分子形成酵素は他の大環状分子形成酵素と逐次的に区別できることが示唆されました。しかし、BsbD2や同じクレードに属する他のタンパク質では、それぞれの機能を担う連続的な特徴や特徴的なアミノ酸残基を同定することはできませんでした。今後、BsbD1, BsbD2の変異体やホモログを異種発現させることにより、クレードIII 酵素の配列と機能の関係を明らかにする予定です。