Bisucaberin B生合成遺伝子群のクローン作成

Bacteroidetes門からはHSD型siderophore生合成遺伝子は報告されていないが、多様な細菌分類群のアミド結合形成酵素（酵素Ds）の間で高度に保存されたアミノ酸配列を利用して、保存部分を縮退プライマーセットを用いたPCR増幅によりクローン作成しました。T. mesophilumのゲノムDNAから増幅したDNA断片は、既知の生合成遺伝子と高い類似性を示し、本種に類似の遺伝子クラスターが存在することが示唆されました。そこで、T. mesophilumのゲノムライブラリー（約9.6×10⁴個のフォスミドクローンから成る）をPCR増幅スクリーニング法によりスクリーニングし、全遺伝子クラスターを含むクローンを同定しました。ヒットしたクローンのショットガンシーケンスを行った結果、推定bisucaberin B（1）生合成酵素をコードする遺伝子クラスター（全長8840bp）が存在し、bsb （bisucaberin B）クラスターと名付けられました（図3、表1；受入番号LC090204）。このクラスターには、これまでに報告されている関連生合成遺伝子クラスターで一般的に見られる4つの遺伝子（A～D）ではなく、6つのオープンリーディングフレーム（ORF：bsbA, B, CD1, C2, D2,  E）が含まれていました。

図3. Bacteroidetes門に属する海洋細菌T. mesophilum由来のbisucaberin B生合成遺伝子群（bsb クラスター）の構成図

表1. Bisucaberin B（1）生合成酵素

¹ N末端 204 aa、² C末端 606 aa、³bisucaberin（2）生合成の対応する酵素（MbsA-D）と配列の同一性を比較したところ、MbsA-Dは、bisucaberin（2）生合成の対応する酵素であることがわかった。

最初の2つの遺伝子、bsbAとbsbBは、それぞれ2,4-ジアミノブチル酸脱炭酸酵素とl-リジン-6モノオキシゲナーゼに高い配列相同性を有する酵素をコードしています。この2つの酵素は、リジンの脱炭酸とN-水酸化によって生成される共通の中間体、N-ヒドロキシ-1,5-ジアミノペンタンの生成に関与しています（図2）。3番目の遺伝子bsbEは、膜輸送体タンパク質の一種であるMFS (Major Facilitator Superfamily) タンパク質をコードしています。このタイプの遺伝子は、他の既知のHSDベースのシデロフォア生合成遺伝子クラスターでは見つかっていません。MFSファミリーの主な機能の一つは、抗生物質などの小分子の輸送／輸出であり、それによって薬剤耐性に寄与しています。そこで我々は、BsbEが化合物1の細胞外への分泌を促進している可能性が高いと推測しました。
bsbクラスターと関連クラスターとの最も顕著な違いは、遺伝子CとDに対応するDNA配列の冗長性です。表1に示すように、bsbクラスターにはアシル基転移酵素（酵素C）とアミド結合形成酵素（酵素D）に相同性を示す2組のオーソログが存在します。特に、1組のオーソログは、N末端（204アミノ酸残基）とC末端（606アミノ酸残基）の異なるドメインからなる推定二機能性酵素（BsbCD1）をコードする単一のキメラORFを形成し、それぞれアシル基転移酵素（BsbC1部分、緑で示す）およびアミド結合生成酵素（BsbD1部分、紫で示す）と相同性を示します（図3および表1）。BsbC1部分とBsbC2部分の配列の同一性は44%であり、両酵素は海洋メタゲノム由来の bisucaberin（2）生合成遺伝子群がコードする対応酵素、MbsCと32%の同一性を有していました。アミド結合形成酵素と推定されるBsbD1部分とBsbD2部分のアミノ酸の同一性は50%であり、これらの酵素はMbsDとそれぞれ42%と46%の同一性を示しました（表1）。したがって、BsbCD1とBsbC2-D2のセットはいずれも化合物1の生合成の候補酵素であるが、1の構造と生合成スキーム（図1、図2）を考慮すると、1の生産には1セットの酵素CとDのみが必要であると考えられます。さらに、他の関連する大環状分子の生合成では、単一の酵素Dsが複数のアミド結合形成を触媒することが報告されています（図2）。したがって、このクラスターに含まれる遺伝子CとDの冗長性が特に注目されます。