C. antiquaとAlteromonas sp.Dとの共培養

以上の実験結果から、Alteromonas sp. Dの殺藻作用の少なくとも一部は、化合物1〜4に起因することが強く示唆されたが、これらの化合物は実際の海洋環境とは全く異なる培養条件で生産されたものでした。そこで、微細藻類が繁殖する環境に近い条件下で、questiomycinの生産とその殺藻作用について検証を行いました。C. antiquaをAlteromonas sp. Dと共培養し、過剰な栄養分を含まない改良SWM-3培地で培養しました。植え付け2日後、ほとんどの藻類細胞は死滅し、フラスコの底に沈殿したが、D株を含まないC. antiquaの培養物は正常な成長を示しました。

上記の共培養培地と藻類細胞の抽出物をLC-MS分析した結果、藻類が繁殖している海水と同様の条件で、確かに化合物1が生成していることが確認されました（図3）。ただし、その計算濃度は 0.31 ng/mL (1.46 nM) であり、化合物 1 の LC₅₀ 値の約 400 倍でした。なお、この実験では他のquestiomycin 2-4 は検出されていません。藻類の初期密度や培養期間が異なるため、2つの実験における1の活性を直接比較することはできないが、濃度の大きな差は、1の作用のメカニズムに何らかの洞察を与えるものであると考えられます。

図3. D株を含まないC. antiqua培養物（黒）、共培養物（ピンク）、questiomycin A（1）標準品（青）の抽出液のLC-MSクロマトグラム。共培養培地中の化合物 1 の計算濃度は 0.31 ng/mL であった。

そこで、上記実験におけるLC₅₀値と1の検出濃度の有意差は、Alteromonas sp. Dがquestiomycic以外の殺藻性物質を生産したため、あるいはD株が微細藻類に接近して1を生産し、1の局所作用により藻類細胞が溶解したためと推測されました。後者の場合，Alteromonas sp. Dは藻類に接触したときのみC. antiqua を殺すことができるが，半透膜で藻類と分離した状態では殺すことができません。この考えを検証するため、C. antiquaとD株を分離膜の有無にかかわらず共培養し（図4）、条件Aでは細菌と藻類が物理的・化学的に自由に接触できるのに対し、条件Bでは生物間で化学的接触のみが可能であることを確認しました。菌の接種から7日後、条件AのウェルではC. antiquaの細胞はすべて溶解したが、条件Bの細胞は生存していました（図4）。LC-MS分析の結果、条件-A培地中の1の濃度は1.5 nMであり、前回の共培養実験とほぼ同じであったが、条件-B培地中の1は検出限界以下であり、分離培養ではquestiomycinが全くあるいは微量に生成されたことが示されました。

図4. 分離しない場合（A）とフィルターで分離した場合（B）のAlteromonas sp. D とC. antiqua  の共培養（ポアサイズ0.4μmの膜を使用）

これらの結果は、代替殺藻性分子の存在の可能性を否定するものではないが、貧栄養環境下で微細藻類と殺藻性細菌が物理的に接触することが、questiomycinのような殺藻性分子を生成する一つのきっかけとなり、接触した細胞を殺すには、わずかな量の殺藻化合物で十分だという考えを強く支持するものです。この仕組みは、藻類を殺す細菌にとってはコスト的に有利であり、また、環境中に広がる毒性分子が少ないため、HABの予防に利用する上でも有益であると思われます。questiomycinの殺藻活性のメカニズムや、本菌の殺藻性分子の生合成制御については、今後解明すべき興味深い問題です。また、実際の環境下におけるquestiomycinの存在と機能についても調査する必要があります。しかし、今回得られた、藻類を殺す細菌に含まれる殺藻性分子の同定は、HABで起こる化学生態学的現象のさらなる理解に大いに役立つと思われます。