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シャーレの準備
＜動画字幕＞シャーレの準備
新聞紙見開き1枚分セロテープと糊を用意してください。
シャーレなのですけど必ず中乾いていることと
加熱滅菌かけていきますけど中が濡れていると途中で割れてしまうことがあるので
必ず中乾燥していること
できるだけ乾燥しているものを選んでください
それでも枚数が足りない場合は止むを得ないので
キッチンペーパー渡すので拭き取ってもらって乾かしてください。
身の部分と蓋の部分を重ね合わせて同じ向きで5枚重ねていってください。
新聞の開くところありますよね。
半分に折って開くところから閉じている方にシャーレをぐるぐると巻いてゆきます。新聞紙でシャーレを巻いたときに隙間が無いようにしてもらいたいのですね。
巻いていくのはひだ折でやっていきます。
お見せします。
まず5枚同じ方向に重ねてぐるぐると1回巻いてください。
巻いたらどちらか片方しっかり折り込んでお腹で押し付けておさえてあげてください。
もう片方を軽く引っ張りながらひだひだ状にしていきます。
シャーレ丸いのでひだ折りでそろえた方がまとまりやすいです。
十分に折れたらしっかりぐるっと巻き込んでください。
それでもう片側が開いていますからこちらも同じように引っ張りながらひだ折りにしていってください。
巻き込んでいきます。
引っ張るときにあまり強く引っ張ると新聞紙が破れてしまうので加減をするようにしてください。
最後この先端の部分に糊をつけてもらいます。
糊をたっぷりつけて結構なので
乾熱滅菌かけると新聞紙がパリパリに乾いてしまします。
乾くまではこの糊でしっかりこの部分を止めるような形になります。
ただ少し糊は弱いのでこの上からセロテープで張り付けて剥がれないようにしてください。
こういう状態で少し振ってみて重なっているシャーレが擦れてガシャガシャいうようだと少し緩いのでその場合できれば巻き直してもらったほうがいいです。
これは蓋が少し緩いのでガシャガシャいいますけどシャーレ同士が擦り合って動くようだとよろしくないので
もう一度巻き直ししてください。
三角フラスコの準備
＜動画字幕＞三角フラスコの準備
300㎖か500㎖の三角フラスコですけど口の部分を閉じてもらう形にします。
口を閉じるときは綿栓を使ってもらいます。
最近はシリコン栓というもう少しいい栓がありますけど学生実験では綿栓を使っていきます。
この綿栓は複数回再利用が可能なので前に先輩たちが使ったものが段ボール箱に入っています。
ちょうどこういうような形をしている栓があるのでこれは型がついているので扱いやすいかと思います。
それで口の部分にねじりながら押し込んでいく。
ちょうどくびれのところまで栓を押し込んでもらうように栓をしていってください。
少し引っ張ってみて簡単に抜けないようであれば大丈夫です。
少し持ち上げてみて落ちないようであれば大丈夫です。
この状態で乾熱滅菌できます。
新しい栓を使いたい人はこういう布団綿があるのですけどこれを使ってみてください。
だいたい10㎝角くらいのものになりますけどちぎってきて
端どこか1か所ちぎって栓を作るときの核にします。
これをちょうど真ん中に置いてあげて栓の部分を押し込みながらねじっていってください。
先と同じような新しい栓ができます。
新しいものが好きな人は新しいものを使ってください。
最後 新しい綿の場合は先端にはみ出している部分ボリュームがあるのでトリミングしてやりやすいサイズにしてください。
あまり刈込み過ぎないように気を付けてもらいたいと思います。
後でここの部分実際に栓を抜くときに手の小指の部分で作業してもらうことになるのであまり刈込み過ぎてしまうと操作がやりづらいのである程度残しておくといいかと思います。
こういう栓をつめてください。
三角フラスコも直接班名書いてもらって結構ですので
白い部分以外のところにマジックで班名書いていただいて結構です。
中試験管の準備
＜動画字幕＞中試験管の準備
オートクレーブをかける中試験管になります。
試験管のほうは昨日乾燥機の中に入れてもらっていて十分に乾いているかと思います。
試験管は至って簡単で
こういう商品名がシリコ栓という商品名なのですけどシリコンの錘状の栓があります。
これをしっかり閉めてもらう。
ねじ込んで閉めてください。
ねじ込むと皺ができるので
皺ができると隙間から微生物が入り込む可能性がありますから
その隙間を解消してしっかりと栓を閉めてください。
実際オートクレーブかけるときにはこの栓が濡れないように
アルミホイルでカバーしてオートクレーブに入れてゆく形にします。
乾熱滅菌
＜動画字幕＞乾熱滅菌
ここは301滅菌室ですね。
入って左のほうに白い立方型の機械が2台あります。
これが乾熱滅菌機です。
まず外側の説明からいきますけど右側の下のところに主電源があります。
それを入れてもらうとディスプレイがありまして
そこに何かしら表示が出てくるはずです。
今ちょうど、緑色の数字が2時間を示します。
オレンジ色の数字が160℃と温度の設定ができています。
それから蓋を開けていきますけど、中の方ですけど熱源が電気式のヒータが下の方に入っています。
熱源が下からくることでかなり高温になりますから
それで、新聞紙で包んだシャーレを下段に置くと場合によっては燃えてしまうこともあるので新聞紙で包んだシャーレは上の段に置くようにして下さい。
三角フラスコは下の段。
これが中の庫内の壁に触れないように置いてください。
できれば一つ離して奥も必ず離して置くようにしてください。
できるだけいっぱいになるようにつめてもらいたいと思います。
全部入れ終わったら、蓋を閉めてもらって、
ここに「滅菌中」と書かれているロックを必ずかけてもらいます。
実はここのロックがすごく簡単に開いてしまって
少し経つとすぐに開いてしまうものですから
滅菌中に蓋が開いてしまうと、中に急に酸素が入って引火して
しまう時があり危険なのでロックするのを忘れないようにして下さい。
ちょうど手元の位置なのですけど、START/STOPボタンがあります。
これを1回押すとさっきの2時間160℃に向けてやって、
それをもう1回押すと今みたいにピッとなって
今これ160℃に上げていますという
右肩上がりの表示がされているようになります。
オートクレーブ
＜動画字幕＞オートクレーブ①
圧力計kg/㎤とMPa表記のものとあります。
一般的にはkg/㎤になっています。
それから黄色は水銀の温度計があるのですけどもそれから後ろの方に付いている弁が圧力調整弁になります。
黒いネジが付いているのが排気弁と呼んでいます。
それから、残りの一つは圧力調整弁です。
タイマーです。
タイマーと赤いボタンでガスのオンオフができます。
それから時間のコントロールもできます。
半自動式のオートクレーブになっています。
それからもう少し下、熱源になりますけど熱源はガスコンロに着火して下からお湯を沸かすという使い方です。
実際の使い方になりますけど、最初に蓋を開けてこの蓋に水を入れてゆきます。
オートクレーブの中、見せてもらってもいいかな。
こういう目皿といいますけど水を入れるところの水位をある程度確保するために
目皿を必ず入れてください。
目皿の下の部分がつかりづらいので水を必ず入れてください。
水を入れ終わったら、オートクレーブをする機材を入れてもらいます。
全部入れ終わったら蓋を閉めていきます。
元栓をまず開きます。
そのあとタイマーをセットします。
15分でセットします。
外側ですね、外側の目盛りが59分、北海道の周波数じゃないですけど、
外側の目盛りで15分になるように調節してください。
そのあと、赤いボタンを押す。
それから、上の蓋をしめていきます。
ネジは全部で8つ。
それで、対角線にあるものを均等の力で締めて対角、対角となるように締めてゆきます。
ワッシャーが上になるように。
しっかりと手で絞めていって、全体が均等になるように蓋と身の部分を締め付けるという形で締めてください。
あまりきついと、後でとれなくなることがあるので必要以上に締め付けることはないです。
手で回して止まったところからだいたい¼回くらい締め付ければ十分だと思います。
締め終わったら、ガスコンロのガスに火を着火します。
まず最初に一回押し回しして、3時から12時の方向に口火を点火してください。
口火が点火したら9時の方向までガスを全開にしてください。
この時、ガスコンロの位置がちゃんと中心になっているかどうか自分で調節してください。
＜動画字幕＞オートクレーブ②
開口ですね、開いてみてください。
排気弁の方ですけど、あまりやり過ぎてしまうと栓が取れてしまうので取れない程度に開口してください。
蒸気出ます
30分くらいかかると思いますけど、30分くらい経つと蒸気が出てきます。
圧力調整弁の裏側にも弁があって、圧力で押されるとこれが持ち上がります。
持ち上がり始めたら圧力調整弁を閉めてください。
分銅を一番右のほうに持って行って圧力調整弁を閉めてください。
分銅は手動なので、重りがかかる状態になっています。
だいたいこれで1.2気圧かかるような位置に調整されています。
もし圧が高過ぎたら圧力調整弁を少し手前に戻して中の蒸気を1.2に保つようにしてください。
その後、2～3分すると排気弁のほうから後ろに穴があって蒸気が排出されます。
そうしたら排気弁を締め付けてください。
締め付けると今度は圧力計が上がっていって、1.2に達します。
タイマーが自動的に働いて15分カウントダウンします。
もし気圧が1.2を超えるようであれば圧力調整弁の重りを手前に少しずつ寄せるようにして圧力調整をしてください。
繰り返しますけど、このオートクレーブ高温になっています。
ですから、素手でやると間違いなくやけどするので軍手をつけて作業してください。
それから、白衣ですけども腕をまくらず降ろすようにして作業してもらいたいと思います。
終わったあとですね、タイマー自動的に戻してもらってもいいかな。
タイマーのカウントダウンが始まると1分前になるとすごくうるさいブザーがけたたましく鳴ります。
1分間鳴り続けて消えます。
そうするとガスが自動的に遮断されて赤いボタンが消灯します。
ガスが自動的にガスコンロのほうに遮断が伝わります。
そうしたら、中のオートクレーブかけ終わったものを取り出すという作業をしてゆきます。
この排気弁ですね、黒いネジの付いた弁、これを少しずつ開けて中の水蒸気を排圧してもらいます。
一気に抜かないように気を付けてください。
一気に抜くと遊ぶ弁まで中の蒸気がかかってやけどすることがあるのでゆっくり抜くようにしてください。
この時、圧力計の圧力が徐々に下がっていくような形で対応させていきます。
圧力計が0になったら圧力調整弁を開けて中の圧を抜いていってください。
これでもう完全に抜けた状態です。
弁がひしゃがない状態まで解放してください。
そうしたら蓋の部分のネジを緩めていって順次、開けてゆきます。
ものすごく熱いので十分気を付けてください。
最後に、蓋を開けるとき中にかなり高温の蒸気が残っています。
なので、蓋を開けるときは一気に開けるようにしてください。
終わったら、試験官を取り出してもらって乾燥器の中にいれてください。
ガス式のが3台あります。
一番手前のものだけ圧力計の目盛りが旧式の目盛りになっています。
一番奥に電気式のほぼ全自動のオートクレーブが1台あります。
どこかの班一つだけこっちを使ってもらうことになります。
それはそれで使い方示しますけど水を入れて中に入れて蓋を閉め、後はスタートボタンを押すだけです。
カゴですね。
オートクレーブはかごの中に入れてやるものです。
取り出すときオートクレーブの温度がすごく上がっていますから。
場合によっては壁にぶつけてやけどしてしまうことがあるので
危険防止のためにカゴを基本的には使っていくことにします。
コッホ窯
＜動画字幕＞コッホ窯
中を見てもらうと、これを目皿といいますけどこういう底上げした形のお皿が入っています。
これを必ず底に入れるようにしてください。
オートクレーブと一緒なのですけど目皿が少し浸るくらいまで水を入れてください。
あまり目皿を超えて(水を入れて)三角フラスコ等が水の中につからないように少し気を付けてください。
水蒸気を使って管を溶解する方が溶けやすいので水につからないように気を付けてください。
必ずこれを入れて水を入れ忘れないようにしてください。
空焚きをしないように気を付けてもらいたいと思います。
実際使うように三角フラスコを入れて三角フラスコの蓋はアルミホイルでキャップして中を還流するようなかたちにしてもらいます。
だいたい15分に1回くらいよく撹拌して、寒天を溶かしてもらうという形になります。
蓋は必ず閉めた状態で使ってもらうかたちになります。
みなさんのところにガスコンロを置いています。
必ず台座がありますので、台座の上にこのバーナーを置いてください。
みなさんの実験台のところにガスの元栓があるのでふたを抜いてこのホースさしてしっかりバンドで止めて使ってください。
ガスバーナーの根元のところですけど、ここに金属製のくるくる回るバルブみたいなものが付いています。
これは空気の調整口です。
最終的に空気を入れ過ぎてしまうと火が付かない、あるいは不完全燃焼してしまう形になるので最初にこれをうまく調整して青い火、赤い還元炎が出ないように調整をしてください。
それから、ここにもう1つガスバーナー側のコックがついています。
横にするとガスが閉じて縦にするとガスが出ます。
これも調整しながらガスバーナーに火を点けてください。
どちらでもいいですけど、少しずつガスを出してマッチで火を点けた方がいいかと思いますけど
このガスの穴の部分がありますけどここのそばに持って行って全体にガスを付けるかあるいはコッホ窯を上にのせておいてゆっくりガスを出して
ガスが少しずつ手前のほうにきたときに火を点けると全体にぼっと火が点きます。
その時気を付けてもらいたいのが、手を焦がさないように十分気を付けてもらいたいですけどどちらかの点け方で付けていただければ結構です。
このガスコンロ点けているときは本当にですね、誰か必ず火が消えてないかよく見るようにしてください。
火が消えてガスだけ出ていて結構大変なことになることがたまにありますので
それだけはないように十分始める前から責任をもって
火がしっかり点いているか見るようにしておいてください。
平板培地の作製
＜動画字幕＞平板培地の作製①
(窓やドアが)全部閉まった状態であることを確認してください。
その後、自分の実験台ですけど、エタノールのスプレーでよく消毒をしてもらいます。
三角フラスコですね、デモンストレーション用で冷えているものを使いますがみなさんのはかなり熱いです。
水道水を使って、直接水をあてて冷やしてください。
だいたい60℃くらいまで冷やします。
少し触って、少し熱いなと思うくらいまで冷やしてください。
水をあててよく撹拌しながら冷やしてください。
冷やし過ぎないように気を付けてください。
40℃くらいで寒天は固まってしまいます。
冷やし過ぎるともう一度溶かし直さないといけませんので固まらない程度にしてください。
自分の手をエタノールスプレーで消毒してください。
今度はガスバーナーで無菌操作をですね。
学生実験ではガスバーナーを使って簡易的な無菌の空間を作り出すということをしていきます。
ガスバーナー各班で4本用意しているのでそのうちの1～2本を元栓につないでください。
ガスバーナー点けてもらいます。
火を点けてください。
ガスバーナーの使い方は大丈夫ですかね。
下がガス、上が空気です。
ガスの量を調整して空気の量を調整して青い炎ですね、赤い炎を出さないように気を付けてください。
炎の高さを半径とした円。
それからちょうど火が舞い上がっていますから上からの落下細菌、バクテリアが落ちてくるのですけども上昇気流で追い出すという形で自分の半径が無菌の空間になります。
ですから後ろに人が通ったりして炎が揺れると無菌の空間が壊されてどんどん(細菌が)中に入ってしまうので無菌操作をしている時には、後ろ通る時できるだけゆっくり歩くように、無菌空間を壊さないように気を付けてもらいたいと思います。
＜動画字幕＞平板培地の作製②
炎の高さは15～20㎝くらいにしてください。
次は滅菌したシャーレを出してゆきます。
新聞紙を丁寧に外していって中身を出してもらいます。
それも無菌の空間の中で作業してもらいます。
蓋のほうを上に5枚重ねて全部同じ向きに自分の正面にガスバーナーとシャーレを持ってきてください。
今度、培地の三角フラスコのほうですけど麻ひもを外して硫酸紙外して
それから1枚中綿が入っていますので、中綿の部分外してゆきます。
このとき少し濡れているので中綿をとるのと同時に、綿栓がとれてしまうことがあるのでとれないように気を付けて外していってください。
こういう状態です。
それで培地は60℃で熱くてですね、ずっと持っているのは、結構困難と思いますので軍手をして作業してもらうことになります。
まず綿栓を外していきます。
小指と手のひらでぐっと押さえてねじりながら栓を抜いてください。
抜くと同時に三角フラスコの口の部分ですけど火の中を通して軽く火炎滅菌をしてください。
それでこの状態でシャーレを全開しないで少しだけ開けて培地を注ぎ込んでゆきます。
ゆっくりゆっくりシャーレ1枚20㎖ですけどゆっくりゆっくり流し込んでいって
底一面に寒天の培地が広がるくらいまででだいたい15～20㎖入っています。
広がって、あと5～6㎖注ぎ込んだらそれで十分に注ぎ込まれているので
1枚どかしてそのシャーレを実験台の上に置いていってください。
それを繰り返してゆきます。最初にみなさんは10枚ですね。
この平板培地を作ってもらうことになります。
培地を注ぎ込んだら、寒天を硬化、固めていきたいので、できるだけ温度冷やした方がいいので、実験台の上に直接置いて、速やかに固まるようにしてください。
また重ねてしまうと保温効果でなかなか寒天が固まらないということになりますのでできるだけ1枚1枚実験台に直接置くようにしてください。
これを繰り返してゆきます。
所定の枚数、5枚もしくは10枚注ぎ込んだら、まだ培地が残っている場合は、残っている培地、無菌操作をしているので無菌の状態を保って保管することができます。
また三角フラスコの口の部分を火炎滅菌して栓をして栓をしっかりして、この状態で無菌の状態を保つことができます。
明日以降、なにか雑菌とか入って無ければそのままこの培地また溶かして使うことができます。
15～20分くらいで寒天固まってくると思います。
逆さまにして蓋でも身でもいいのですけど、必ず班名と培地の種類を書いてもらって
37℃のインキュベーターの中に入れて寒天培地の表面にある水分を十分に乾燥させるということをします。
37℃に入れておくと、もし雑菌が混入している場合、雑菌の混入もコンタミしているかがわかります。
斜面培地の作製
＜動画字幕＞斜面培地の作製
滅菌した中試験官、寒天培地のほうですけど
MA、これを斜面培地という形状に加工してもらいたいと思います。
こういうような状態で置いてください。
試験官のシリコン栓のところから培地の先端部分が
だいたい6㎝くらい開いていてくれるといいです。
あまり近すぎると雑菌が混入してしまうので
できれば5-6㎝離した状態
こういう状態にして寒天を固めていくということをします。
継代培養
＜動画字幕＞継代培養
昨日と同じように無菌操作の準備、実験台ですね消毒してもらって
ガスバーナー火をつけてもらってできるだけ自分の正面に機材をつけてください。
白金線は4組配っていたはずなので4人同時にできるかと思います
ガスバーナーも4台配っていますので4人同時にやってもらって結構です。
それから、扉、窓が閉まっていること確認してください。
まずは継代培養を見せてゆきます。
これは斜面培地から斜面培地に菌を植え継いでいく方法としてよく使われるものです。
みなさんにはこういう斜面培地に菌が白く生えているのがわかりますか。
斜面の表面のこれ大腸菌なのですけどいっぱい菌が生えているやつを渡します。
この表面に生えている菌を白金線で少しとってですね
新しい昨日作ってもらった斜面培地のほうに植え継いでいきます。
それで基本的には凝結水ですね。
凝結水に菌を懸濁していくようなかたち
そのあと懸濁した水を斜面の全体のだいたい半分くらいまで塗り広げていく
そういうかたちでやってもらいます。
菌が増殖している斜面培地を最初持ってもらって試験官の蓋を開けて
試験官の口の部分を火炎滅菌してください。
それから白金線の方も先端と白金線の真ん中くらいまで十分に火炎滅菌してください。
その後、寒天に突き刺して冷やします。
菌のほう触らないように寒天に突き刺して冷やしてください。
十分に冷えたら菌体を白金線の先端にとっていきます。
今日、先端に採れているかどうか不安なので少し白く菌体がついているのがわかるくらいまでとっても結構です。
慣れてくればほんの少しで十分微生物増殖するのがわかります。
試験官の口をあぶってシリコン栓を一回閉めます。
試験官たてに置いておいてください。
新しい培地をとって蓋を開けて、試験官の口を火炎滅菌してこのまま凝結水のところに菌を懸濁してください。
菌を十分懸濁するようなかたちでカシャカシャと菌を溶くように動かしてください。
十分懸濁できたら懸濁した菌液を斜面の半分くらいまで塗り広げるように白金線の先端を動かしてください。
その後、斜面に沿って(白金線を)ゆっくり抜いてゆきます。
また火炎滅菌してシリコン栓の蓋を閉じる。
こういう形にすると継代培養ですね
新しい培地に植え継いでゆくことができます。
学生実験を通してこの継代培養かなり頻繁に使っていくことになりますのでやり方を覚えてください。
今の操作を無菌の空間の中でやってもらうので特に菌を取り終わった後必ず無菌の空間の中に白金線を置くようにしてください。
菌を取った後、もう1回火炎滅菌してしまいがちなのですけどももう1度火の中にくべないように気を付けてください。
液体培養
＜動画字幕＞液体培養
それから次は、液体培地のほうもいきます。
もう1回同じ操作 もう1回今回配る菌株の斜面培地を持ってください。
菌が十分増殖している斜面培地、白金線、それから白金線フォルダーを十分に火炎滅菌してください。
シリコン栓を開けて試験官の口の部分をよく火炎滅菌して
もう1回白金線フォルダーを火炎滅菌して
寒天に突き刺して冷やしてください。
菌体をとってゆきます。
そしてまた火炎滅菌して口を閉じる。
蓋を開けたあと閉める前も必ず試験官の口、軽くでいいので火を通して火炎滅菌してください。
液体培地をとります。
蓋を開けていきます。
菌を接種します。
液体の中に菌体を懸濁するようにしてくれれば結構です。
それで十分 菌が接種します<。
シリコン栓をして試験官立てにたててください。
純粋分離培養
＜動画字幕＞純粋分離培養
純粋分離培養いきます。
これは斜面培地から平板培地のほうに接種してゆきます。
平板培地の斜面から菌をとってきたらどこか一か所ですけど
平板の表面に菌を一か所だけ少し付けるとういうやり方をします。
白金耳、丸いものに持ち替えて ここに付いている菌を
菌の塊を寒天培地の表面に広げていって
広げながら一つ一つの細胞ごとになるように表面にばら撒いてゆく
こういうようなやり方になります。
一つの細菌からまた旺盛に生物が増殖して
我々の目に見える細菌の集落ができてきます。
これを繰り返すことによって細菌の単離(分離)ができるようになります。
こういうことを目的とした培養です。
白金耳の動かし方としては半分を目安に半面を使ってできるだけ菌の密度を薄くしてあげる。
残りの半面を使ってできるだけ1個1個の細胞がばら撒くような形にしてもらう こういう動かし方をします。
ですので上の面は軌跡が重なっても良いですけども
下はできるだけ動かすとき重ならないようにしてください。
まず斜面培地ですね。
菌が増殖している斜面培地をとります。
白金線、白金線フォルダーを十分に火炎滅菌していきます。
白金線を冷やしていきます。
菌をとってください
菌をとっていきますけど心持ち少なめですね。
あまり白い塊が見えると純粋分離培養うまくいかないことがあるので心持ち少なめにしてください。
ちょっと触る程度です。
蓋を閉めます。
とった菌体を寒天培地のどこか一箇所に上の方か下の方どちらでもいいですが
表面タッチして触って付けてください。
ただつけたところどこだかわかるように覚えておいてください。
もし心配だったら寒天傷つけてあげるとどこにつけたかわかりやすいかと思います
十分に白金線は火炎滅菌します。
今度は白金耳に持ち替えてもらいます。
十分に火炎滅菌します。
白金耳の方は寒天平板培地の表面を少し触って冷やしていきます。
あまり寒天の中に埋め込まないように気を付けてください。
表面にちょっとタッチして、じゅっていいますけどそれで十分冷えます。
2～3秒触ってくれれば冷えるかと思います。
菌をつけた上半分の面を使ってできるだけ菌体の密度が薄くなるように白金耳の軌跡を動かしていきます。
このくらいゆっくりやっても全然問題ありませんので最初はゆっくりやってください。
慣れてくれば早めにシュッシュと動かせるようになるかと思います。
寒天は思いのほか柔らかいので中に白金耳が
突き刺さらないように気を付けてください。
培地の寒天の表面を傷つけないように気をつけてください。
そうしたら一度蓋を閉じてもらって
逆さまに持ち替えて残りの半面のほうで白金耳の軌跡が重ならないように動かしていきます。
これちょっと見やすくしているので大雑把に動いていますけども
もう少し細かく軌跡が重ならないように動かしていってください。
終わったら蓋を閉めて白金耳の方も火炎滅菌していきます。
平板培地の方ですね
必ず上下転倒して保管してもらっていますけど
微生物での実験ではずっとこのあと微生物の培養は必ず上下転倒させて使っていきます。
こうすることによって雑菌の混入を防ぐ効果があります。
寒天培地に雑菌が入りづらくなります。
OF試験培地への接種
＜動画字幕＞OF試験培地への接種
白金線を使います。
今、最初だけ無菌空間を作ってやりますので見ていってください。
実験操作するときはまず実験机の上をエタノールで拭いて火を焚いて無菌空間を作ってください。
OF試験の培地に接種するときは穿刺培養といって白金線を突き刺すように菌を接種します。
まず白金線を火炎滅菌してください。
それで白金線を冷やしてください。
斜面と試験官の間に白金線を刺して冷やしてください。
それから菌体をとります。
同じ株を2本のOF試験培地に接種していきます。
まず1本目
試験官の口を炙ってそのまま真ん中に底まで突き刺してください。
突き刺して抜きます。
綿栓をしっかり閉めます。
続いてもう1本目に同じように穿刺培養をしていきます。
これも真ん中に底まで刺してください。
終わったら白金線を火炎滅菌します。
今2本に接種したのですけども1本に流動パラフィン
滅菌した流動パラフィンを重層していきます。
だいたい1.5㎖くらい入れてください。
これによって流動パラフィンが入っている方は
嫌気的にグルコースを利用しているかどうかみることができます。
流動パラフィンはディスポーザブルの5㎖ピペット
を使って重層していきます。
ここにスポイトゴムを取り付けてだいたい1.5㎖くらいいれてください。
流動パラフィンを使う時は(フラスコの)口を火炎滅菌
火であぶって無菌空間下で流動パラフィンをとってください。
また口を火炎滅菌して流動パラフィンを重層していきます。
OF試験培地の上に流動パラフィンを重層するとこのようになります。
この時にOF試験の培地が 赤い部分がたくさん入っているものに関しては
綿栓にパラフィンがついてしまうことがあるので
できればピンクの部分が少ない培地に流動パラフィンを入れた方がいいのかなというところです。
今の流れが1株について行うOF試験培地への接種になります。
これを海洋細菌と育成細菌すべてで行ってください。
1点注意点としては、とりあえず先に全部穿刺培養をして
最後まとめて流動パラフィンという班がたまにあるのですけど
それはそれと接種してからの時間が経つと
たまに嫌気ででているはずなのに酸素使った代謝が起こってしまって
結果がよろしくないことがあるので必ず1株ずつ穿刺したらパラフィン重層するというような形をとってください。
塩類要求性試験培地への接種
＜動画字幕＞塩類要求性試験培地への接種
塩類要求性試験上の培地への接種のデモンストレーションをしてもらいます。
まず始めに塩類要求性培地①～④の4種類の培地を準備してください。
今、実験机の上に乗っけてもらっているように4種類の塩類要求性培地を準備してください。
では、早速やってみましょうか。
この操作では白金線を使います。
同じように試験官と培地の間に白金線を刺して冷やしてから菌体をとります。
次は、平板培地に線を描くように接種をする画線培養をやっていきます。
まず塩分要求性①のプレートに線を1本引くようになぞってください。
この時に培地を削らないようにやさしく線を描いてください。
続いて、滅菌せずに②の培地に同じように画線培養をしていきます。
③の培地に関してはオキシダーゼ・カタラーゼ試験でも菌体を使いたいので菌を多めに接種していきたいです。
今は線を1本描いたのですけど
線をこんな感じでなぞると、何回か往復させて
菌体を多めに採れるように1本の線を描いてください。
今までの白線は画線培養1本だったのですけど
今度は少し多めに往復させて1本の線を描くようにしてください。
それで塩類要求性③の培地に接種をしてください。
それでは④に接種してください。
④は①、②と同じ様に1本の線で菌体を接種します。
今の4枚のプレートに接種で1株終了という形になります。
同様に他の株についても塩類要求性培地に接種をしていってください。
その時に1枚のプレートがあったら
今、1株接種してもらったと思うのですけど
他の株も同じようにこういうレイアウトで接種をしてください。
平板培地が少ないところがあると思うのですけど
ここに関してはプレートに4株を接種していきます。
なので十字の様な形で接種をしてください。
これ25℃ですね。
37℃陸生細菌に関しては3株あると思うのですけど
Es1とMi3とB7
B7は増殖がいいので他の2株と離してできるだけ端の方に寄せて画線培養を行ってください。
DNA・ゼラチン分解試験培地への接種
＜動画字幕＞DNA・ゼラチン分解試験培地への接種
点滴培養をしていきたいと思います。
これに関しては、DNA分解試験・ゼラチン分解試験の培地が該当します。
では続いて点滴培養に移ります。
これもまず始めに白金線をよく熱して滅菌してください。
菌体をとります。
今度は点滴培養というものをやっていきます。
これは白金線でシャーレの上に軽く触れてあげて点を描くような菌の接種方法になります。
この様な感じで今TAがやっているように軽く平板培地の表面に触れて菌の接種を行ってください。
続いてゼラチン分解能試験培地に同じように点滴培養をします。
以上が点滴培養の操作になります。
各種培地に接種してもらったのですけども接種した後に
どこに何の菌を置いたかわからなくなってしまうので
必ず終わった後は速やかにラベルをしてもらった方がいいかなと思います。
オートトロフの継代培養
＜動画字幕＞オートトロフの継代培養
実験机を正常に保つためにまずエタノールで拭いてください。
それから自分の手もエタノールで滅菌してください。
オートトロフは基本的に嫌気条件で増殖するのでみなさん今まで使っていたような
シリコン栓プラス試験官というものではなくて
ブチルゴムで上は密閉されています。
黒いキャップをして中は密閉されています。
さらに中の気圧は大気圧の3倍の圧力になっていますので
ここに衝撃が加わると割れて爆発します。
なので乱暴に扱わないように気を付けてください。
培養する前にブチルゴムの部分をエタノールで拭いて滅菌してください。
このオートトロフに関してはシリンジと針を使って培養をしていきます。
最初にシリンジ開けてもらって速やかに針に接続してください。
ここちょっとしっかりねじってゆるみの無いようにしてください。
じゃないとここから液が漏れます。
培養する時に守ってもらいたいのがシリンジのプランジャーという部分
白い部分を必ず手のひらで押さえておいてください。
ここをフリーにしておくとロケット状態になって飛ぶので
必ず手のひらで押さえるようにしてください。
押さえた状態で先ほど滅菌した培養液のほうに刺していきます。
この時にゆっくり垂直
針がブチルゴムの真ん中を通るように垂直に刺していただいて
このように圧がかかってくるので2、3回プランジャーを押してあげてください。
それで150㎕の培養液を採ります。
採った後は少し気層の部分100㎕ほど吸ってあげてください。
試験官を水平にして気層の部分を100㎕ほど採ってください。
この状態でゆっくり針を垂直に抜いてください。
今度、培地に接種をしていきます。
ゆっくりプランジャーを押して気層を除いてあげてください。
針先に培養液が出てくればOKです。
このようにしずくが出てくるので、この状態に仕上げてください。
そしてまたプランジャーの部分を手のひらで押さえながら刺して
培養液を入れて入れた後は2、3回プランジャーを押してシリンジの中を洗うようなイメージで押してください。
最後は培養液を全部入れて空気の層だけ2,3回押して何も取らずにゆっくりと抜いてください。
これが1株についての菌の接種の流れになります。
最後、エタノールで拭いてあげてラベルをして55℃でインキュベートという形になります。
顕微鏡観察用サンプルの作成
＜動画字幕＞顕微鏡観察用サンプルの作成
最初にスライドガラスに菌を塗抹することから始めます。
スライドガラスは1回エタノールで拭いて汚れをとってください。
エタノールが乾いたことを確認してから使用してください。
最初に懸濁液をのせていきます。
懸濁液をのせる時は白金耳、先が丸くなっているほうですね。
これを使っていきますので火炎滅菌します。
火炎滅菌し終わったらこのまま懸濁液に刺していただいて
1/3ASW若しくは生理食塩水を白金耳で採っていきます。
白金耳をつけてそっと抜くと表面張力で白金耳の真ん中、液が少し取れています。
この状態でスライドガラスをちょんちょんと触って懸濁液をスライドガラスにのせます。
このように水滴がつくと思うのでこういう形で懸濁液を1回とってください。
では続いてこの懸濁液に菌体を懸濁していきます。
次は白金線を使います。
これも火炎滅菌してください。
試験官と培地の間に刺して白金線を冷やした後に菌体をとってください。
菌体の量が多くても見づらいですし少なくても見づらいのでここは慣れかなと思うのですけどあまりとり過ぎない方がいいのかなと思います。
菌体をとった白金線を先ほどのせた懸濁液の上でちょんちょんとこれもカシャカシャと混ぜなくてかまいませんのでちょんちょんと表面を触れてあげることで菌体を懸濁液に懸濁できますのでこういう形で菌をのせてあげてください。
使い終わったら火炎滅菌をしてください。
これで菌体の懸濁は終了です。
続いてこのまま風乾をさせます。
これは自然乾燥ですね。
なのでこのまま水滴が乾くまで待ってください。
乾燥した体で次のステップを説明していきますが、次は固定というステップになります。
今回は火炎固定を行っていきます。
ガスバーナーの火を少し小さくしてもらってガスバーナーの火のだいたい5㎝くらい上を数回、スライドガラスを往復させて火炎固定をしていきます。
これが火炎固定になります。
あまりガスバーナーが近すぎると菌体が燃えてしまうのであまり近づけないようにだいたい5㎝くらい上を2-3回くぐらせて火炎固定してください。
続いて染色ステップに移ります。
先程説明したレクレルのアルカリ性メチレンブルー溶液を固定したところに垂らしてあげてください。
この状態で1分間静置して1分間終わったら今度洗っていきます。
洗う時はスライドガラスをひっくり返して裏から試料が載っていないところから優しく洗い流してください。
この後はまた風乾、自然乾燥させて乾燥し終わったら顕微鏡で観察という形になります。
生菌数測定：平板塗抹法
＜動画字幕＞生菌数測定平板塗抹法①
いろいろな操作をするのですけども
全て無菌の空間の中でやるようにして下さい。
まず、使ってもらう試料の話をしますけど
こういうポリビンですけどこれを各班2種類ずつ渡していきます。
ポリビンの形状全く一緒なのですけどサンプルは小田島川のサンプルです。
管理研究棟のすぐわきのところとそこの河口域で採っています。
間違いないようにしてください。
このサンプルを希釈していきます。
希釈は75%人工海水を三角フラスコに入れて作ってくれていると思います。
これを滅菌した中試験管に9㎖ずつあらかじめ分注しておいてください。
こういうようなものを作っておいてください。
これを3本ずつ2グループに分けますので6本あればいいと思います。
正確に9㎖ずつ定量的に希釈をしていくので9㎖正確にいれてください。
これを希釈液に使っていきます。
ディスポーザブルのピペットです。
これを使ってもらう形にしますので後で教卓に置きますから1本持って行ってください。
開け方ですけど吸い口の部分出してもらって、あるいは紙とビニールが剥がれますからそういう剥がし方でもいいです。
取り出したら必ず無菌操作下でこういう形で持ってください。
支えるのは親指と中指で支えてもらって、この人差し指で吸い口の部分を押さえる形にして、フリーで開けておいてください。
通常ピペットは垂直方向に使うのですけども微生物実験の場合は水平方向
無菌の空間の中に入れて水平方向に保つようにしてください。
1㎖のピペットを渡していくのでこっちを使ったほうがやりやすいかと思います。
1㎖吸ってもらって斜め読みで結構なので ちょうどメニスカスのところが
目盛の線が合うように斜め読みでいいので取ってください。
これピペットはいずれも先端のピペットなので全部噴き出すとちょうど1㎖とれるような形になります。
あらかじめ用意しておいた9㎖分注し滅菌した75%人工海水ですけどここに入れていきます。
それでしっかり押さえながらシリコン栓を小指と手の腹で持ってねじりながら開けてもらって試験管の口を火炎滅菌してここに入れていってください。
全部噴き出してください。
終わったらまた火炎滅菌して蓋を閉じます。
これで9㎖に対して1㎖試料が入っているのでここで試料が1/10に希釈されてる形になります。
栓をよく閉めてその後、よく撹拌してもらいます。
実験室かラボのほうにいくとボルテックミキサーというミキサーがあるのですけどもここの実験室に無いものですから手動でみなさん撹拌してください。
手のひらに押し当てて何回かたたくと渦を作れます。
これを10回くらいやってよく撹拌してくれれば結構です。
これで10倍希釈液ができます。
これを繰り返していって1000倍の希釈液まで作ってください。
同じくまたピペットですね、1㎖ピペットを新しくおろしてもらって、10倍希釈したものを火炎滅菌して、これを1㎖とってください。
火炎滅菌して閉じます。
新しい9㎖の滅菌した75%人工海水、ここに入れていくことによって1/100になります。
終わったらまた栓をよくして手のひらにあてて渦を作って撹拌をしてください。
それでこれをもう1回やると1000倍希釈液ができます。
まず希釈液列を作っておいてください。
10倍希釈液列といいます。
途中でどの試験管にどの希釈をしたかわからなくなってしまうので
必ず前もって試験管には10¹希釈とか10²希釈とか10³希釈とか
書いておくと便利かと思います。
これで希釈の操作になります。
＜動画字幕＞生菌数測定平板塗抹法②
希釈液列ができたら 今度は平板培地に各希釈液の資料を滴下していきます。
それぞれの希釈段階ですけど 平板培地を2枚ずつ使ってもらいます。
1枚に100㎕＝0.1㎖ずつ各希釈液を垂らしていってください。
垂らすとき2枚同時にやってもらっていいので2枚用意してもらって<
蓋のほうを上に向けてもらって やはり新しいピペットを使ってください。
10倍希釈液をとって栓を開け(試験管の)口をあぶって
最低0.2㎖あればいいので 0.2㎖以上とってください。
シャーレの蓋少しだけ開けてほぼ中央に0.1㎖滴下していってください。
先端少し液が残る場合は平板の表面を少しタッチして全部液滴をとってください。
続けてもう1枚
ここでピペット操作誤って液量がうまく垂れないと
定量的にいかなくなっちゃうので気をつけてください。
心配な人は0.1㎖とって1枚に垂らす もう1枚に0.1㎖とって
垂らすという形でやってもらえたらと思います。
液が残ったら同じ希釈液に戻してください。
T字型をしている平板培地に液滴を広げる役割をする道具をわたしていきます
ガンマ線で滅菌したものでプラスチックの袋に閉じ込められています。
開けるときは必ず手で持つ柄のほうから開けていってください。
絶対この先端のT字の部分は触らないように気を付けていただきたいと思います。
コンラージ棒あるいはスプレッダー 塗り広げるための役割を持っているのでスプレッダーといいます。
これを使って液滴を十分に塗り広げていきます。
塗り広げるとき (蓋を)全開にすると落下細菌が混入しやすいので
少しカバーをするように蓋をもってください。
親指と中指で持って スプレッダーはいつも同じ左右か前後の動きだけです。
平板を2つの指を使って回していくことによって
均一に塗り広げることができます。
最初少し液体が前面に広がるので滑りがいいのですけど
だんだん乾いてくると 20秒くらいするとだんだん抵抗が出てきます。
そうすると試料が寒天に染み込んでいってよく塗り広げられている証拠になります。
少し抵抗が出てきて だいたい30秒くらいをめどに塗り広げてください。
そうしたら蓋を閉めて 逆さまにして培養してもらうという形です。
今の操作がやりづらい人は 持っても結構です。
逆に今度この場合は スプレッダーをいろいろな方向に塗り広げて
できるだけ試料を均一に 平板培地上に塗り広げるようにしてください。
これによって細菌細胞がひとつひとつの細胞が平板の表面に分散していく形になります。
それで1枚破ってしまいますけど 寒天 今まで使っていて気付くと思いますけどやわらかいです。
ちょっと滑ってこうなると 簡単にバリバリと割れてしまします。
割れてしまうと この平板使えないので できるだけ丁寧にやっていってください。スプレッダーもやはり1枚の平板に対して
新しいスプレッダーを使っていってください。
同じように蓋を開けて塗り広げてもらいます。
これで塗抹が終わりになります。
塗抹が終わったら できれば蓋のほうがいいのですけど
蓋にどのサンプル 上流か下流か希釈がどの希釈か 念のため何㎖滴下したか
それを必ず明記するようにしてください。
これで10倍希釈が2枚できます。
同じく100倍希釈のものが2枚できてきます。
それから1000倍希釈のものが2枚できてきます。
各班2グループに分けて 1グループで6枚の平板が出来上がってくる形になっています。
微生物実験 必ず実験室に持ってきたら基本的には全て消毒するというのが原則なのでクレゾール石鹸液をビーカー等々に入れてスプレッダーとピペットを消毒しておいてください。
一晩消毒すれば十分だと思います。
生菌数測定：混釈平板法
<動画字幕>生菌数測定 混釈平板法
それからもう1つ、混釈平板法っていうのも説明が書いてあります
これもごく簡単にできるので今日やろうかと思います
混釈平板法はあまり環境中に微生物がいて欲しくないようなサンプルに対してやることが多いです
環境衛生検査だったり食品の検査だったりによく使います
名前の通り寒天培地の中にサンプルを混釈して(混ぜ込んで)いきます
ちょっとお見せします
こちらの方は小田島川の河川試料の原液を使っていきます
滅菌した新しい空のシャーレを準備してください
ここに無菌操作下で1mlサンプルをとってください
これも中央に滴下をしてください
その後ZoBellの寒天培地まだ三角フラスコに残ってると思うので
あらかじめ溶かして60℃程に冷やしておいてください
それをシャーレの中にゆっくり流し込んでいきます
いつもの平板を作るのと同じやり方です
終わったらまだ固まる前にゆっくり培地と試料が混ざるように
5～6回でいいので撹拌していってください
この状態で固めていきます
固まったら逆さまにして培養していきます
培養すると先ほどの寒天の中に菌の集落ができてきます
今回1ml入れているのでかなりびっしり色々な微生物が入ってくると思います
直接計数用試料の固定
＜動画字幕＞直接計数用試料の固定
直接計数のサンプル固定のほうにいきます。
直接計数のほうは みなさんには緑色のキャップの50㎖の
ファルコン(コニカル)チューブですけど
ここにあらかじめ2㎖ずつ10%グルタールアルデヒドを分注したものを渡していきます。
一応ですね、サンプル遮光しておいたほうがいいのでアルミホイルで巻いています。
ちょっとやりづらいですが
もしやりづらければサンプル注入する時には外しても結構です。
終わったら(アルミホイルで遮光)しておいてください。
50㎖のコニカルチューブ用のラックが無いものですから
誰かに持っていてもらって
無菌操作下で 10㎖のピペットを使って
ここに18㎖海水を加えていってください。
蓋を閉めて よく混合してもらって これで固定が終わります。
今度これを染色して蛍光顕微鏡で観察していきますけど
それまで冷蔵庫で保管するかたちになります。
上流、下流のサンプルそれぞれ1本ずつあれば結構なので
固定をしておいてください。
気を付けてもらいたいのが 海水を口で吸うのはいいのですけど
グルタール混合したものそれを絶対口で吸わないでください。
直接計数
＜動画字幕＞直接計数①
DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)が溶けている水溶液になります。
すでにろ過滅菌したものです。
これを各班1本ずつ持っていってください。
5㎖のシリンジを使っていきますので5㎖シリンジ
次にフィルターのほうにいきますが我々のほうで染色をしてやっていて
ズダンブラックという黒い色素でフィルターを染色しているのですけど
この余分な色素を洗い流すところからスタートします。
使わないフィルターなので手で取っちゃいますけど(ピンセットを使用してください)。
こういうフィルターです。
光沢がある面と無い面があります。
光沢がある面が表です。
みなさんは必ずピンセットでつまむようにしてください。
すごく薄いプラスチック製なので簡単に破れてしまいます。
ピンセットもフィルターの真中のほうつまむとすぐに破れてしまうので
必ず端のほうをつまむように使ってください。
このように黒いフィルターを使ってもらいます。
ズダンブラックのアルコール溶液に漬けてあるのでこれを洗浄液に浸して余分な黒い色素を洗い流すことからやってもらいます。
これからフィルターをセットするフィルターフォルダーです。
こういうコマのような形をしているものです。
ネジを外すとパーツが3つあります。
円柱状のものと円錐状のものと中に必ずOリングが1枚入っています。
このOリングが大事なのでこれが無いものは使わないでください。
これも滅菌あるいは消毒したものをみなさんに渡す形にします。
各班で2個ずついくと思います。
洗浄液。
それから10㎖のディスポーザブルピペットと洗浄液にグルタールアルデヒドが入っています。
それからサンプルもグルタールアルデヒドが入っているので絶対に口で吸わないようにしてください。
ピペッターも用意しますので10㎖ピペット等々を使って作業するようにしてください。
あとピンセットですね。
自分の試料とこれだけあればいいと思います。
今ここでは無菌操作しませんけどみなさんは無菌操作下でするようにしてください。
上流のサンプルと下流のサンプルと2グループに分かれてそれぞれ1個ずつやっていただければ結構です。
＜動画字幕＞直接計数②
最初にサンプル 試料にDAPIをいれるところからいきます。
手順通りいくとまず 固定したサンプル、みなさん冷蔵庫に保管していると思います。
そこにDAPIの溶液を加えていってください。
試料20㎖用意していると思いますのでそこにDAPIの溶液0.1㎖ずつを入れていってください。
今ちょっとお見せしませんけど1㎖ピペットを渡すので1㎖ピペットに1番小さいスポイトゴムつけて0.1㎖吸って入れていってください。
それから次のステップですけどズダンブラック染色液で染色して洗浄液に入れて洗ってもらいます。
シャーレに洗浄液を5㎖ほど入れてもらってそこでよくフィルターを洗ってください。
よく洗ったフィルターにプラスチック製のポリカーボネイトフィルターをセットしていきます。
セットするところをお見せしていきます。
まずフィルターフォルダーの円柱状の台のほうを今のような形で滅菌したシャーレの上に置いてください。
その上にフィルターを置いていきます。
光沢面を上にしてください。
それでOリングを必ずしたのを確認した円錐状のほうのパーツ
しっかりねじ込んでいってフィルターをしっかり固定する形になります。
フィルターがずれてしまうと液が全部漏れてしまうので必ずしっかりと入っていることを確認してください。
その後シリンジですね 5㎖のシリンジをセットしていきます。
今のように開けてもらってプランジャーとシリンジの部分を外してもらって
シリンジの本体だけをセットします。
ちょうどフィルターフォルダーはシリンジの先端がしっかりはまるようにできています。
ここにDAPIで染色したサンプルを加えていきます。
ちなみにDAPIの染色は冷蔵で7分以上染色をしてもらいます。
いろいろ染色液を加えた後にフィルターを洗っていたりするとすぐ7分くらい経ってしまうと思います。
染色済みのサンプルですけどこれを3㎖だけ濾過をしていきます
ピペッターを使って入れていってください。
この時に液がざっと漏れるようだとフィルターがしっかりセットされていないのでもう一度フィルターをセットし直してください。
新しいフィルターをセットし直してください。
試料をシリンジの中に入れたらプランジャーを使ってゆっくりゆっくり押していきます。
この時あまり強く押すとフィルターフォルダーの端のほうから液が飛び散ってくることがあります。
グルタール(アルデヒド)が入っているので目に入ると失明の危険が高くなってくるのでこの作業気を付けてやるようにしてください。
あまり勢いよく押さないようにしてもらいたいと思います。
それから必ずシャーレを使って液を受けておくということをしっかりしておいてください。
濾過が終わったら一度シリンジを外してもらって空気だけを通してフィルター上にある余分な染色液を取り除きます。
今度 洗浄液を使って一度フィルターを洗ってあげます。
余分なDAPIの溶液を洗い流してあげるということをします。
洗浄液のほうは新しいピペットを使って洗浄液は5㎖もう一回(フィルターに)通してください。
もう一回濾過をしていきます。
洗浄液を一度(フィルターに)通して またシリンジを外して空気だけ通してもらいます。
フィルター上の余分な洗浄液を押し出してもらいます。
これで染色と洗浄の操作が終わりです。
最後このフィルターをスライドガラス上に置いてプレパラートを作っていきます。
＜動画字幕＞直接計数③
必ずしも新しいスライドガラスでなくても結構です。
洗浄済みのスライドガラスを1枚用意してほぼ中心の位置でいいのでスライドガラスの中心の位置にイマージョンオイルを1滴垂らしてあげてください。
これでフィルターを固定していきます。
その上にフィルターを乗せていきます。
必ず濾過した細菌がのっている面を上にします。
今フィルターを置いてあるように光沢面を上にしてください。
その後さらにもう1滴オイルを垂らします。
新しいのをみなさんに渡しますので絶対古いものは使わないでください。
新しいカバーガラスをこうして垂らしてもらいます。
こういう形でマジック等を使ってイマージョンオイルがカバーガラス全面にいきわたるように軽く押し当ててください。
あまりカバーガラスが移動してしまうとフィルターの上にのっている細菌の細胞をゆすってしまうことになるのでそうならないように一方向にゆっくり押し付けて
前面にオイルが広がるようにしておいてください。
これでプレパラートの作製が完了します。
