课程：応用発生工学実習　3：精子凍結

［材料］シロサケ精子、サクラマス卵、精子、どんぶり、タオル、軍手。
［準備］軍手、ドライアイス、凍結防御剤溶液、ディスペンサー
［方法］

①       氷冷した精子希釈液 4.5ml を 100 ml のビーカーにとる。

②       精子 1.5 ml を加え、直ちに振とうして希釈液と混合する。精子を混ぜた時間にストップウォッチをスタートさせる。

③       直ちにディスペンサーに吸い込み、ドライアイスの穴の上に100 μlずつ滴下する。精子を混合してから１分で滴下を終了する。

④       滴下した精子が凍るのを待つ。

⑤       液体窒素のタンクから保存用のチューブを取り出す。

⑥       凍結精子ペレットを、ドライアイスをひっくり返して下の紙の上に落とす。直ちに紙を折曲げて凍結精子を保存用チューブの中に移し、チューブを液体窒素タンクへ移す。
注）ドライアイスと液体窒素を扱う実験者は軍手を着用する。

［材料］シロサケ精子
［準備］軍手、液体窒素(発泡スチロール)、ピペットマン（p1000）、ピペットチップ（ブルー）、ストロー管（500μℓ用）、ストロー管ホルダー、密栓用パウダー、凍結防御剤溶液、トング
①       ストロー管の栓の部分に日付と班番号を書き入れる。

②       3mLの凍結防御剤溶液を15mLチューブに分注

③       1mL（5倍希釈済み）の精子を入れて良く混合

④       ストロー管の栓側にピペットマンに装着した先を少しだけ切ったブルーチップを挿入し、ストローが満タンになるまで精子希釈液を吸引する（栓のところまで来ると自然と吸えなくなる）。

⑤       パウダーをストローの栓とは逆側の口に押し込み封をする。

⑥       同様の作業を精子希釈液が無くなるまで行う。

⑦       4℃で1~2分間インキュベートし、液体窒素上のホルダー上に静置する。

⑧       ホルダー上で15分以上置いた後、液体窒素中に投入
すべての実験終了後、液体窒素中のストローを回収し、タンク中で保存。

応用発生工学実習　3：精子凍結