Topic outline
(1) ゼブラフィッシュ
① 採卵日の前日の夕方に雌雄を用意する。
② 雄個体を採卵用の水槽に2−3尾移す。雌雄は色調で区別(雄の方がオレンジがかっている)
③ 採卵用の水槽の上にステンレス製のかごをのせる。かごの下部が水に浸っていることを確認。
④ 雌の水槽から2個体雌を選んで、雄を入れた水槽の上のかごの中に入れる。
⑤ かごに水槽の蓋を乗せて、雌雄が飛び出ないようにする。
⑥ 次の日の朝に、水槽の下の雄をネットで捕まえ、上のかごに移す。
⑦ 雄が雌を追うかどうかを確認する。
⑧ 追い始めたら間もなく産卵が確認される。(されない時もある)
⑨ 20分程放置し、受精卵が水槽の底に溜まるのを待つ。
⑩ 雌雄の入ったかごを、他の水槽の上に移す。
⑪ ホースのサイフォンとプラスチックシャーレ、茶こしを用意する。
⑫ ホースに水を入れ、水が出ないように片方の口を茶こしの中にいれ、茶こしはプラスチックシャーレの上に乗せる。
⑬ 水槽の下に沈んだ卵を、ホースのサイフォンを使って、茶こしの中に回収する。
⑭ プラケースに飼育水を入れ、その中に茶こしに溜まった受精卵を入れる。
⑮ 受精卵を口が大きなピペットを用いてガラスシャーレに移す。
⑯ 大きなピペットを用いてガラスシャーレから水を取り除く。
⑰ 受精卵の上から0.1%トリプシンリンゲル液(100mlに120μℓ程の0.1N NaOH溶液を入れpHをアルカリ性にする)を入れて静置する。実体顕微鏡で卵膜が2枚にはがれてくるのを観察。
⑱ 卵膜が剥けてきたら、大きなピペットで、卵を吸い込まないようにトリプシン溶液を動かし、卵膜と胚を分離する。泡立てないこと。泡立てると胚が泡と触れて爆発する。
⑲ シャーレを静かに動かして、卵膜除去卵を中央部に集める。
⑳ 卵膜除去卵を一次培養液を満たしたアガロースシャーレに移す。
(2) キンギョ
① 採卵の前日午前中に雌の飼育水を新しいものにかえる。(環境刺激)
② 前日の夕方(5時から10時くらい)に雌雄の腹腔内にhCGを注射。(雌1-10unit/gBW、雄0.1〜1unit/gBW)
③ 当日の朝から排卵をチェック
④ 雄を麻酔し、ヘマトクリット毛細管に精液を採取し、人工精漿で50-100倍に希釈し冷蔵庫へ保存。(人工精漿:NaCl 5.61 g/L, KCl 5.23 g/L, CaCl2・2H2O 0.33 g/L, MgCl2・6H2O 0.22 g/L, NaHCO3 0.2 g/L, pH8.0)
⑤ 雌を麻酔し、サランラップ上に排卵卵を搾出する。乾燥しないようにカバーをかけて室温で保存。(2時間以内に受精を終わらせる)
⑥ プラスチックマドラーを使ってサランラップ片の上に必要量の卵を移す。
⑦ 黄色チップを使い、希釈精液を媒精し、爪楊枝の背で軽く混ぜる。
⑧ 受精液(0.2%urea, 0.24%NaCl水)をシャーレに満たし、媒精卵を入れて受精する。
⑨ 卵が集中しないように、爪楊枝で切るように撹拌し、散らしておく。
⑩ 受精液を捨て、卵膜除去液(0.1%トリプシン、0.4%尿素を含むリンゲル液)を入れ、静置する。
⑪ 卵膜が透明になってきたら、シャーレを水平に動かして卵膜除去卵をシャーレ中央に集める。
卵膜除去卵を一次培養液を満たしたアガロースシャーレに移す。
(3) サケマス
* この実験は2名で行います
Ⅰ.採卵・受精
① 池に網を入れ親魚を捕獲し、親魚の雌雄を確認する。
② メス親魚の体をタオルで拭き水分を拭う。
③ 一人(利手に軍手をする)が♀の頭を、もう一人(利手でないほうに軍手をする)が尾を持ち、尾の側の人が腹を搾り、卵を丼の中にいれたザルに取る。(糞や小水、水を混ぜない)
④ 卵をサケマス用リンゲル液で洗い、どんぶりに移す。さらに卵の表面までリンゲルを加える。
⑤ オス親魚を同じように2人で支え、腹を搾って精子をプラスチックコップへ入れる。(小水が混合しないように注意する)
⑥ 適量の卵をザルに取り、リンゲルを切って他のどんぶりに移す。
⑦ どんぶりの未受精卵に精子をかけ、卵を良く混ぜた後、リンゲル液を少し加え(精子の付活)、更に河川水(あるいは井水)を丼の半分位まで加える。数分置く(受精)。
⑧ 受精卵をざるにあけ、水を切る。もう一度、丼に河川水(あるいは井水)を入れ、受精卵を入れて洗う。何回か繰り返して精子が残らないようにする。
⑨ 飼育培養する場合は、イソジン液で消毒した後、孵化槽へ移す。染色体操作を行う場合は、フレンチプレスのセル内に収容し、圧力処理を行う。
Ⅱ.サケマス卵の卵膜軟化