＜動画字幕＞直接計数②
最初にサンプル 試料にDAPIをいれるところからいきます。
手順通りいくとまず 固定したサンプル、みなさん冷蔵庫に保管していると思います。
そこにDAPIの溶液を加えていってください。
試料20㎖用意していると思いますのでそこにDAPIの溶液0.1㎖ずつを入れていってください。
今ちょっとお見せしませんけど1㎖ピペットを渡すので1㎖ピペットに1番小さいスポイトゴムつけて0.1㎖吸って入れていってください。
それから次のステップですけどズダンブラック染色液で染色して洗浄液に入れて洗ってもらいます。
シャーレに洗浄液を5㎖ほど入れてもらってそこでよくフィルターを洗ってください。
よく洗ったフィルターにプラスチック製のポリカーボネイトフィルターをセットしていきます。
セットするところをお見せしていきます。
まずフィルターフォルダーの円柱状の台のほうを今のような形で滅菌したシャーレの上に置いてください。
その上にフィルターを置いていきます。
光沢面を上にしてください。
それでOリングを必ずしたのを確認した円錐状のほうのパーツ
しっかりねじ込んでいってフィルターをしっかり固定する形になります。
フィルターがずれてしまうと液が全部漏れてしまうので必ずしっかりと入っていることを確認してください。
その後シリンジですね 5㎖のシリンジをセットしていきます。
今のように開けてもらってプランジャーとシリンジの部分を外してもらって
シリンジの本体だけをセットします。
ちょうどフィルターフォルダーはシリンジの先端がしっかりはまるようにできています。
ここにDAPIで染色したサンプルを加えていきます。
ちなみにDAPIの染色は冷蔵で7分以上染色をしてもらいます。
いろいろ染色液を加えた後にフィルターを洗っていたりするとすぐ7分くらい経ってしまうと思います。
染色済みのサンプルですけどこれを3㎖だけ濾過をしていきます
ピペッターを使って入れていってください。
この時に液がざっと漏れるようだとフィルターがしっかりセットされていないのでもう一度フィルターをセットし直してください。
新しいフィルターをセットし直してください。
試料をシリンジの中に入れたらプランジャーを使ってゆっくりゆっくり押していきます。
この時あまり強く押すとフィルターフォルダーの端のほうから液が飛び散ってくることがあります。
グルタール(アルデヒド)が入っているので目に入ると失明の危険が高くなってくるのでこの作業気を付けてやるようにしてください。
あまり勢いよく押さないようにしてもらいたいと思います。
それから必ずシャーレを使って液を受けておくということをしっかりしておいてください。
濾過が終わったら一度シリンジを外してもらって空気だけを通してフィルター上にある余分な染色液を取り除きます。
今度 洗浄液を使って一度フィルターを洗ってあげます。
余分なDAPIの溶液を洗い流してあげるということをします。
洗浄液のほうは新しいピペットを使って洗浄液は5㎖もう一回(フィルターに)通してください。
もう一回濾過をしていきます。
洗浄液を一度(フィルターに)通して またシリンジを外して空気だけ通してもらいます。
フィルター上の余分な洗浄液を押し出してもらいます。
これで染色と洗浄の操作が終わりです。
最後このフィルターをスライドガラス上に置いてプレパラートを作っていきます。
