生菌数測定：平板塗抹法

＜動画字幕＞生菌数測定平板塗抹法①

いろいろな操作をするのですけども

全て無菌の空間の中でやるようにして下さい。

まず、使ってもらう試料の話をしますけど

こういうポリビンですけどこれを各班2種類ずつ渡していきます。

ポリビンの形状全く一緒なのですけどサンプルは小田島川のサンプルです。

管理研究棟のすぐわきのところとそこの河口域で採っています。

間違いないようにしてください。

このサンプルを希釈していきます。

希釈は75%人工海水を三角フラスコに入れて作ってくれていると思います。

これを滅菌した中試験管に9㎖ずつあらかじめ分注しておいてください。

こういうようなものを作っておいてください。

これを3本ずつ2グループに分けますので6本あればいいと思います。

正確に9㎖ずつ定量的に希釈をしていくので9㎖正確にいれてください。

これを希釈液に使っていきます。

ディスポーザブルのピペットです。

これを使ってもらう形にしますので後で教卓に置きますから1本持って行ってください。

開け方ですけど吸い口の部分出してもらって、あるいは紙とビニールが剥がれますからそういう剥がし方でもいいです。

取り出したら必ず無菌操作下でこういう形で持ってください。

支えるのは親指と中指で支えてもらって、この人差し指で吸い口の部分を押さえる形にして、フリーで開けておいてください。

通常ピペットは垂直方向に使うのですけども微生物実験の場合は水平方向

無菌の空間の中に入れて水平方向に保つようにしてください。

1㎖のピペットを渡していくのでこっちを使ったほうがやりやすいかと思います。

1㎖吸ってもらって斜め読みで結構なので　ちょうどメニスカスのところが

目盛の線が合うように斜め読みでいいので取ってください。

これピペットはいずれも先端のピペットなので全部噴き出すとちょうど1㎖とれるような形になります。

あらかじめ用意しておいた9㎖分注し滅菌した75%人工海水ですけどここに入れていきます。

それでしっかり押さえながらシリコン栓を小指と手の腹で持ってねじりながら開けてもらって試験管の口を火炎滅菌してここに入れていってください。

全部噴き出してください。

終わったらまた火炎滅菌して蓋を閉じます。

これで9㎖に対して1㎖試料が入っているのでここで試料が1/10に希釈されてる形になります。

栓をよく閉めてその後、よく撹拌してもらいます。

実験室かラボのほうにいくとボルテックミキサーというミキサーがあるのですけどもここの実験室に無いものですから手動でみなさん撹拌してください。

手のひらに押し当てて何回かたたくと渦を作れます。

これを10回くらいやってよく撹拌してくれれば結構です。

これで10倍希釈液ができます。

これを繰り返していって1000倍の希釈液まで作ってください。

同じくまたピペットですね、1㎖ピペットを新しくおろしてもらって、10倍希釈したものを火炎滅菌して、これを1㎖とってください。

火炎滅菌して閉じます。

新しい9㎖の滅菌した75%人工海水、ここに入れていくことによって1/100になります。

終わったらまた栓をよくして手のひらにあてて渦を作って撹拌をしてください。

それでこれをもう1回やると1000倍希釈液ができます。

まず希釈液列を作っておいてください。

10倍希釈液列といいます。

途中でどの試験管にどの希釈をしたかわからなくなってしまうので

必ず前もって試験管には10¹希釈とか10²希釈とか10³希釈とか

書いておくと便利かと思います。

これで希釈の操作になります。

＜動画字幕＞生菌数測定平板塗抹法②

希釈液列ができたら　今度は平板培地に各希釈液の資料を滴下していきます。

それぞれの希釈段階ですけど　平板培地を2枚ずつ使ってもらいます。

1枚に100㎕＝0.1㎖ずつ各希釈液を垂らしていってください。

垂らすとき2枚同時にやってもらっていいので2枚用意してもらって<

蓋のほうを上に向けてもらって　やはり新しいピペットを使ってください。

10倍希釈液をとって栓を開け(試験管の)口をあぶって

最低0.2㎖あればいいので　0.2㎖以上とってください。

シャーレの蓋少しだけ開けてほぼ中央に0.1㎖滴下していってください。

先端少し液が残る場合は平板の表面を少しタッチして全部液滴をとってください。

続けてもう1枚

ここでピペット操作誤って液量がうまく垂れないと

定量的にいかなくなっちゃうので気をつけてください。

心配な人は0.1㎖とって1枚に垂らす　もう1枚に0.1㎖とって

垂らすという形でやってもらえたらと思います。

液が残ったら同じ希釈液に戻してください。

T字型をしている平板培地に液滴を広げる役割をする道具をわたしていきます

ガンマ線で滅菌したものでプラスチックの袋に閉じ込められています。

開けるときは必ず手で持つ柄のほうから開けていってください。

絶対この先端のT字の部分は触らないように気を付けていただきたいと思います。

コンラージ棒あるいはスプレッダー　塗り広げるための役割を持っているのでスプレッダーといいます。

これを使って液滴を十分に塗り広げていきます。

塗り広げるとき　(蓋を)全開にすると落下細菌が混入しやすいので

少しカバーをするように蓋をもってください。

親指と中指で持って　スプレッダーはいつも同じ左右か前後の動きだけです。

平板を2つの指を使って回していくことによって

均一に塗り広げることができます。

最初少し液体が前面に広がるので滑りがいいのですけど

だんだん乾いてくると　20秒くらいするとだんだん抵抗が出てきます。

そうすると試料が寒天に染み込んでいってよく塗り広げられている証拠になります。

少し抵抗が出てきて　だいたい30秒くらいをめどに塗り広げてください。

そうしたら蓋を閉めて　逆さまにして培養してもらうという形です。

今の操作がやりづらい人は　持っても結構です。

逆に今度この場合は　スプレッダーをいろいろな方向に塗り広げて

できるだけ試料を均一に　平板培地上に塗り広げるようにしてください。

これによって細菌細胞がひとつひとつの細胞が平板の表面に分散していく形になります。

それで1枚破ってしまいますけど　寒天　今まで使っていて気付くと思いますけどやわらかいです。

ちょっと滑ってこうなると　簡単にバリバリと割れてしまします。

割れてしまうと　この平板使えないので　できるだけ丁寧にやっていってください。スプレッダーもやはり1枚の平板に対して

新しいスプレッダーを使っていってください。

同じように蓋を開けて塗り広げてもらいます。

これで塗抹が終わりになります。

塗抹が終わったら　できれば蓋のほうがいいのですけど

蓋にどのサンプル　上流か下流か希釈がどの希釈か　念のため何㎖滴下したか

それを必ず明記するようにしてください。

これで10倍希釈が2枚できます。

同じく100倍希釈のものが2枚できてきます。

それから1000倍希釈のものが2枚できてきます。

各班2グループに分けて　1グループで6枚の平板が出来上がってくる形になっています。

微生物実験　必ず実験室に持ってきたら基本的には全て消毒するというのが原則なのでクレゾール石鹸液をビーカー等々に入れてスプレッダーとピペットを消毒しておいてください。

一晩消毒すれば十分だと思います。